Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.
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Artículo de método
MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono
En este artículo
Resumen
Resumen
Perfiles de microARN (miARN) ha sido de interés para los investigadores que trabajan en diversas áreas de investigación de biología y medicina. Los estudios actuales muestran un promisorio futuro de miRNAs en el diagnóstico y cuidado de enfermedades pulmonares. Aquí, se define un protocolo para miRNA perfilado para medir la abundancia relativa de un grupo de miRNAs predicho para regular genes inflamatorios en el tejido pulmonar de un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias inducida por ozono. Ya se ha demostrado que los niveles de hormonas sexuales circulantes pueden afectar la regulación de la inmunidad innata del pulmón en las mujeres, el propósito de este método es describir un inflamatorio miRNA perfiles de protocolo en los ratones hembra, teniendo en cuenta el ciclo estral etapa de cada animal en el momento de exposición al ozono. Nos dirigimos también a enfoques de la bioinformática aplicable a miRNA descubrimiento y objetivo de los métodos de identificación usando limma, un software de R/Bioconductor, y software de análisis funcional para comprender el contexto biológico y vías asociadas con expresión diferencial de miRNA.
Introducción
microRNAs (miRNAs) son cortos (19 a 25 nucleótidos), que ocurre naturalmente, no-codificación moléculas de ARN. Secuencias de miRNAs son evolutivas conservada entre especies, lo que sugiere la importancia de los miRNAs en la regulación de funciones fisiológicas1. perfiles de expresión de microRNA ha demostrado para ser útil para la identificación de miRNAs que son importantes en la regulación de una variedad de procesos, incluyendo la respuesta inmune, diferenciación celular, desarrollo y apoptosis2. Más recientemente, miRNAs han sido reconocidos por su uso potencial en el diagnóstico de la enfermedad y terapéutica. Para....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Penn State University.
1. evaluación de la fase del ciclo estral
- Frenar correctamente una hembra de ratón C57BL/6 (8-9 semanas) utilizando la técnica de sujeción con una sola mano ratón descrita en Machholz et al10.
- Llenar la pipeta plástica estéril con 10 μL de agua ultra pura.
- Introduzca la punta de la pipeta de plástico en la vagina.
- Suavemente Limpie el líquido de 4 a 5 veces para recolectar la muestra.
- Coloque el final flush que contiene fluido vagin....
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Resultados
Los diferentes tipos celulares observados en los frotis se utilizan para identificar la etapa del ciclo estral del ratón (figura 1). Estos están identificados por la morfología de la célula. Durante el proestro, las células son casi exclusivamente agrupaciones de células epiteliales nucleadas en forma de redondo, bien formadas (figura 1A). Cuando el ratón está en la etapa de estro, las células son células epiteliales squamous cor.......
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Discusión
Perfiles de microARN es una técnica ventajosa para investigación mecanicista y diagnosis de la enfermedad. En este manuscrito, se definió un protocolo para evaluar la expresión de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios en los pulmones de ratones femeninos expuestos a ozono en etapas del ciclo estral diferentes. Métodos para la determinación del ciclo estral, como el método de detección visual, han sido descrito16. Sin embargo, estos dependen de las mediciones de una sola vez y por.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH K01HL133520 (PS) y K12HD055882 (PS). Los autores agradecen a Dr. Joanna Floros para la ayuda con experimentos de exposición de ozono.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 semanas de edad |
| Agua ultrapura | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Pipeta de plástico estéril | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacidad: 1,7 mL |
| Portaobjetos de microscopio esmerilados | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Microscopio | Microscopio Mundial | MW3-H5 | 10x y 20x |
| objetivo Ketathesia- Inyección de ketamina HCl USP | Henry Schein Animal Health | 55853 90 | mg/kg. Droga controlada. |
| Solución estéril de xilacina | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Droga controlada. |
| Etanol | Fisher Scientific BP2818100 | Diluir hasta un 70% de etanol con agua. | |
| Aguja de calibre 21 BD | Biosciences | ||
| Fisher Scientific | 329654 | 1 mL | |
| Tijeras de operación | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, afilada/roma, curva y 9 cm, recta, fina Kit |
| World Precision Instruments | 504616 | ||
| Spectrum Pulverizadores de tejidos Bessman | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacidad: 10 a 50 mg |
| Tubos de microfuga sin ARNasa | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1,5 mL |
| Reactivo TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol ARN MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Respuesta inflamatoria del ratón & Autoinmunidad miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Tubos de PCR de pared delgada, sin DNasa, sin RNasa | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | para 20 μ Reacciones L |
| miRNeasy Suero/Plasma Control de picos | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R | Software La Fundación R | https://www.r-project.org/ | |
| Termociclador o bloque de enfriamiento/calentamiento | general Microcentrífuga | ||
| Proveedor | |||
| de laboratorio general Ciclador de PCR en tiempo real | Proveedor | ||
| Pipeta multicanal | Proveedor de laboratorio general Tampón | ||
| lavado de ARN | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| tampón de digestión de ADN | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| tampón de prelavado de ARN | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Analizador de ozono ultravioleta | Teledyne API | Modelo T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Controladores de flujo másico | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Referencias
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical....
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Reimpresiones y permisos
