Method Article

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

DOI:

10.3791/58683

⸱

November 17th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Neurosciences & Mental Health Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Smart-Aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada1. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo2. El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células3. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular3.

Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión3, 4. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero3. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total5. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D1,6,7,8.

Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta14. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.

Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo15. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula15. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos15. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado15.

Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito16. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico17. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células18. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores17,18 (Complementario de la figura 1).

El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal del centro para Phenogenomics (TCP) se ajustó a las normas del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. Ratones fueron mantenidos en ciclos de luz/oscuridad de 12-h y con libre acceso a agua y alimentos. 7 meses viejos ratones machos C57BL/6J se utilizaron en el experimento de tinción montaje en conjunto.

Nota: Las secciones 1 y 2 están en orden cronológico, con la sección 3 es un paso opcional justo después de la sección 1. Sección 4 puede realizarse para analizar la densidad de tamaño y los vasos sanguíneos de adipocitos después de la terminación de la sección 2.

1. materiales preparación y aislamiento de tejido

  1. Preparar el fresco 1% paraformaldehido (PFA) diluida en 1 x de tampón fosfato salino (PBS) para la fijación del tejido. Preparar los 0,3% surfactante no iónico diluido en PBS 1 x (en lo sucesivo como PBS-0.3T) para el tejido subsecuente pasos de lavado.
    Nota: Para cada tejido, preparar aproximadamente 1,5 mL de 1% PFA para garantizar una inmersión completa. Volumen de fijación puede aumentarse o disminuirse dependiendo del tamaño del tejido.
    Atención: Este paso es peligroso, como PFA es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad) y la manija en una campana de humos.
  2. Eutanasia de animales siguiendo un procedimiento aprobado (p. ej., dislocación cervical o asfixia dióxido de carbono). Sin demora, disecar el tejido adiposo deseado depósitos (p. ej., tejido adiposo blanco inguinal o perigonadal blanco el tejido adiposo)18.
  3. Con tijeras de disección, cortar el tejido en un 100 x 15 mm2 caja de Petri en trozos de aproximadamente 0,5 – 1 cm de tamaño y sumergirlos en tubos de microcentrífuga con 1% PFA. Mantener en hielo.

2. whole-mount tinción de tejido adiposo blanco

  1. Una vez completada la disección, mover las muestras de tejido en 1% PFA del hielo a temperatura (RT) por 1 h y luego se transfieren los tejidos a una placa de cultivo celular 12 o 24 pocillos para el lavado más rápido.
  2. Lavar los tejidos con PBS-0.3T, 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT en un agitador inclinado a 22 º, con inclinaciones de 20 a 25 por minuto como la velocidad.
    Nota: Utilice esta inclinación y la velocidad para todos los pasos posteriores que implican el uso de una coctelera.
    Nota: Si utiliza una línea de ratón multicolor reportero como mT/mG y adicional anticuerpos no es necesario, el tejido está listo para microscopía tras el paso 2.2.
  3. Agregar 0,5 a 1 mL de tampón de bloqueo (5% de suero animal diluido en PBS-0.3T). Poner la placa en la coctelera e incubar durante 1 h en RT
  4. Aspire la solución de bloqueo y añadir anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1% de suero de animales.
  5. Coloque el plato en un agitador a 4 ° C durante la noche.
  6. Al día siguiente, lavar los tejidos con PBS-0.3T 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT
  7. Uso de anticuerpos secundarios apropiados diluidos en PBS-0.3T. Añadir 0,5 – 1 soluciones de anticuerpo secundario de mL en cada pocillo. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en un agitador durante 1 hora a TA.
    Nota: Diluir el anticuerpo secundario en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo.
  8. Después de la incubación del anticuerpo secundario, lavar con PBS-0.3T dos veces durante 5 minutos, cada uno en RT. las muestras de la imagen si no se desea una tinción de lípidos neutros. Si la visualización de las gotitas de lípidos es necesaria utilizando el lípido neutral mancha, lavado con PBS 1 x (sin tensioactivo no iónico) dos veces, 5 minutos cada uno.
  9. Tras los pasos de lavado, incubar con la mancha de lípido neutral diluida con 1:1500 factor de dilución en PBS 1 x durante 30 min en RT Los tejidos están ahora preparados para microscopía. Para la proyección de imagen de futuro, los tejidos pueden almacenarse en esta solución a 4 ° C.
    Nota: Calidad de imagen disminuye con el tiempo; por lo tanto, la mejor época para la proyección de imagen es dentro de 1 o 2 días.
  10. Utilizando pinzas, coloque el tejido en un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm² y colóquelo en un sistema del microscopio láser confocal invertido.
  11. Si la coloración de los núcleos con DAPI se desea, agregar 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI para sumergir el tejido completamente y evitar que se resequen.
  12. Para obtener imágenes de montaje todo manchado de los tejidos en varios planos focales, realizar Z-pilas de 100 – 150 μm en profundidad con 4 – 6 μm tamaño de paso en el aumento deseado.

3. tejido claro e inmunomarcación utilizando iDISCO +

Nota: Este protocolo se basa en los procedimientos anteriormente publicados en9,10,19.

  1. Fijación y tratamiento previo de metanol
    1. Incubar los tejidos en el 4% PFA diluido en PBS 1 x a 4° C durante la noche en tubos de microcentrífuga de 2 mL.
      Nota: Deje los tejidos en los tubos de 2 mL para los siguientes tratamientos hasta la proyección de imagen.
    2. Al día siguiente, lavar los tejidos en PBS 1 x tres veces, durante 1 hora en un agitador a TA.
      Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar la muestra durante la noche en RT o 4 ° C.
    3. Deshidratar los tejidos en RT en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, durante 1 hora. Deshidratar en metanol al 100% a temperatura ambiente durante 1 hora, luego transferir los tejidos frescos 100% metanol e incubar a 4 ° C durante 1 hora.
      Nota: Metanol diluido en agua destilada. Durante la incubación de metanol, no hay necesidad para poner las muestras en un agitador como se sumergen las muestras de tejido.
      Atención: Este paso es peligroso, como el metanol es tóxico. Es altamente inflamable en llamas. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos. Almacenar el metanol de encendido y en un gabinete de seguridad inflamable.
    4. Blanquear los tejidos con 5% de peróxido de hidrógeno (H2O2; 1 volumen de 30% H2O2 diluido en 5 volúmenes de metanol 100%) durante la noche a 4 ° C.
      PRECAUCIÓN: el peróxido de hidrógeno 30% es muy peligroso en la piel y contacto con los ojos. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos.
    5. Rehidratar los tejidos en RT en 80%, 60%, 40% y 20% de metanol y 1 x PBS, posteriormente, durante 1 hora.
    6. Lavado con surfactante no iónico 0,2% diluido en 1 x PBS dos veces, durante 1 hora en un agitador a TA.
  2. Inmunomarcación
    Nota: Llenar los tubos de 2 mL que contiene el tejido de la parte superior del tubo con la solución utilizada en cada paso para evitar la oxidación de tejido como inmunomarcación comienza, hasta que claro se ha completado.
    1. Permeabilizar los tejidos por los de incubación en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) y glicina de 0.3 M a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días.
      Nota: El tiempo de incubación máximo para paso de permeabilización de 37 ° C es de 2 días.
    2. Bloquear los tejidos en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 10% DMSO, suero burro 5% y 1% Fc bloque a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días.
      Nota: El tiempo de incubación máximo para el paso de bloqueo es de 2 días.
    3. Incubar los tejidos en anticuerpos primarios de interés en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, 10 μg/mL heparina, DMSO 5% y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 4 días.
    4. Lave con 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 de μg/mL heparina, en un agitador a temperatura ambiente cinco veces, cada uno por 1 h.
      Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche en RT
    5. Incubar anticuerpo secundario en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, de los tejidos 10 μg/mL heparina y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa durante 4 días.
      Nota: De paso 3.2.5, todas las muestras necesitan ser envueltos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de anticuerpo secundario.
    6. Lavar los tejidos en una solución de 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 heparina μg/mL en un agitador en RT cinco veces, por 2 h.
      Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche a TA.
  3. Tejido de tejido adiposo blanco y la proyección de imagen de volumen
    1. Deshidratar los tejidos contenidos en tubos de 2 mL por incubación en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, cada uno durante 1 hora a TA. Entonces, deshidratan las muestras en metanol al 100% dos veces a TA.
      Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar sus muestras en metanol al 100% durante la noche a TA.
    2. Incubar los tejidos con una mezcla de 2 volúmenes de DCM a 1 volumen de metanol durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador.
      Nota: DCM es volátil. Asegúrese de que los tubos están sellados herméticamente para evitar la evaporación.
      Atención: Este paso es peligroso. DCM es tóxico por inhalación. La exposición prolongada puede causar quemaduras químicas. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad). Utilizar una campana de humos.
    3. Incubar dos veces, los tejidos en DCM de 100% durante 15 min en un agitador a TA.
    4. Incubar a 100% DBE en RT hasta la proyección de imagen y para el almacenamiento de la muestra. Antes de la proyección de imagen, invertir los tubos varias veces para mezclar las soluciones.
      Nota: Llene completamente los tubos con DBE para evitar la oxidación, que puede resultar en tejido claro. No agite los tubos durante la incubación de DBE.
      Atención: Este paso es peligroso. DBE es tóxico. Puede causar irritación a los ojos y la piel. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos.
    5. Imagen de la muestra de todo tejido con un microscopio de luz que coincida con el índice de refracción de DBE solvente orgánico. Realizar apilamiento Z aumento deseado y el tamaño de paso para el tejido entero.

4. ejemplos de análisis de datos de Whole-mount mancharon tejido imágenes con ImageJ

Nota: Vea https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para instrucciones de descarga e instalación.

  1. Cuantificación de la densidad de vasos sanguíneos ( figura 2de lacomplementaria )
    1. Importar las imágenes guardadas del solo canal con inmunotinción de vasos sanguíneos en ImageJ.
      Nota: Las imágenes de cuantificación deben ser coherentes en términos de procedimiento de tinción y la condición de adquisición de imagen. Deben utilizarse reactivos idénticos. El tiempo de exposición, intensidad y la ampliación también deberían ser equivalente en la proyección de imagen de proceso20.
    2. Convertir el color de la imagen en blanco y negro para la cuantificación de densidad de los vasos sanguíneos. Para ello, en la pestaña "Imagen" , seleccione el comando de "Ajuste" , entonces la opción de "umbral de Color" . En el "umbral de Color" Mostrar cuadro, seleccione "Fondo oscuro"20 y seleccione "B & W" bajo el "umbral de Color".
    3. Para medir el porcentaje de área de la señal de los vasos sanguíneos contra el fondo, seleccione la pestaña de "Analizar" , luego el comando "analizar partículas" . En la pantalla de "partículas analizadas", seleccione las opciones "Borrar resultados" y "Resumir" . Haga clic en "Aceptar".
    4. Copie y pegue el valor de la zona de porcentaje en la ficha Resumen en una hoja de cálculo para el análisis. El porcentaje de área indicará la densidad de los vasos sanguíneos. Repita los pasos 4.3.1–4.3.4 para cada imagen individual.
  2. Cuantificación del adipocito tamaño21 (suplementario figura 3)
    1. Importar las imágenes guardadas de los adipocitos en ImageJ.
    2. Para establecer la escala de la imagen, mida la longitud de la escala en pixeles trazando una línea a la escala con una distancia conocida en la imagen usando la herramienta de selección lineal. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Set Scale" . La distancia de la línea que trazó ante se calcularán automáticamente en píxeles.
    3. Aparece el cuadro de pantalla "establecer escala" . Entrar en la unidad de longitud y distancia conocida. Seleccionar "Global" para aplicar la escala para todas las imágenes importadas y haga clic en "Aceptar".
    4. Para elegir el área como el método de medición, en la pestaña de "Analizar" Seleccione el comando de "establecer medidas" . Aparecerá una lista de opciones diferentes para las mediciones. Seleccione la opción de "Zona" y haga clic en "Aceptar".
    5. Con la herramienta Selección a mano alzada, trazar el perímetro de cada adipocito de interés. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Medida (Ctrl + M)" , y aparecerá en el área de los adipocitos. Repita este procedimiento para otros adipocitos en la imagen.
      Nota: Para garantizar mediciones precisas, utilizar varias imágenes para la cuantificación.
    6. Copie y pegue las mediciones de área en una hoja de cálculo para mayor análisis de los datos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido a la fragilidad del tejido adiposo, métodos que implican varios pasos de procesamiento y seccionamiento pueden llevar a la desfiguración de tejido adiposo morfología3 (figura 1A). Sin embargo, el conjunto montaje coloración puede conservar la morfología de los adipocitos, garantizar la precisa interpretación de los resultados (figura 1B).

Fijación excesiva de tejido adiposo lleva a autofluorescence fijad...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.

Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo diferentes p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por subvenciones de las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) de Canadá, piloto y beca de estudio de viabilidad de Banting y Best Diabetes centro (BBDC), el fondo inicial de SickKids a H-K. S., médica centro de programa de investigación (2015R1A5A2009124) a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro planea J r

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LipidToxLife TechnologiesH34477
PECAM-1 anticuerpo primarioMilliporeMAB1398Z(CH)
TH (tirosina hidroxilasa) anticuerpo primarioMilliporeAB152, AB1542
Tinción DAPIBD Pharmingen564907
Microscopio confocal Nikon A1RMicroscopio confocalNikon
Ultramicroscopio ILaVision BioTecMicroscopio fluorescente con imagen de hoja de luz
Alexa Fluor Anticuerpos secundariosJackson ImmunoResearchLongitudes de onda 488, 594 y 647 utilizadas
Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32BioSciences553141
DiclorometanoSigma-Aldrich270997
Dibencil-éterSigma-Aldrich33630
MetanolFisher ChemicalA452-1
Peróxido de hidrógeno al 30%BIO BASIC CANADA INCHC4060
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GlycineSigma-AldrichJ7126
HeparinaSigma-AldrichH3393
Lectin kit I, fluoresceína etiquetadoVECTOR LABORATORIESFLK-2100
F4/80Bio-RadMCA497GA
VECTASHIELD Medio de montaje rígido con DAPIVECTOR LABORATORIESH-1500
Paraformaldehído (PFA)
Tampón de fosfato solución salina (PBS)
Triton-X
Tween
Suero animal (cabra, burro)

References

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