Artículo de método

Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular

DOI:

10.3791/58688

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15 de junio de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.

Resumen

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Se ha demostrado cada vez más que el microambiente tumoral desempeña un papel activo en el crecimiento de la neoplasia y la metástasis. A través de diferentes vías, las células tumorales pueden reclutar eficientemente células estromales, inmunes y endoteliales mediante el secreto de factores estimulantes, quimioquinas y citoquinas. A su vez, estas células pueden alterar las propiedades de señalización del microambiente mediante la liberación de señales, metabolitos y componentes de matriz extracelular que promueven el crecimiento para mantener una alta proliferación y competencia metastásica. En este contexto, identificamos que el componente de complemento C1q, altamente expresado localmente por una serie de tumores malignos humanos, al interactuar con la matriz extracelular de ácido hialurónico, afecta fuertemente el comportamiento de las células primarias aisladas del tumor humano Especímenes. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico (HA) afecta la adhesión de las células tumorales, subyacente al hecho de que las propiedades biológicas de los componentes clave de la matriz extracelular (en este caso HA) pueden ser moldeadas por señales bioactivas hacia el tumor Progresión.

Introducción

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El microambiente tumoral (TME) influye en el desarrollo y la progresión del cáncer, ya que puede proporcionar un nicho permisivo para la supervivencia celular, el crecimiento y la invasión. La identificación de nuevos actores clave en TME puede ser útil para el descubrimiento de nuevas herramientas moleculares para la terapia diana. TME incluye una red compleja y dinámica de células no malignas, como células endoteliales, fibroblastos y células del sistema inmunitario, incrustadas en los componentes de la matriz extracelular (ECM) circundantes, incluyendo colágenos, laminines, fibronectinas, proteoglicanos e hialuronanos. Tanto las células tumorales como las no tumorales sintetizan y secretan componentes de ECM junto con citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y enzimas de remodelación inflamatorias y matriciales que alteran en general las propiedades físicas, químicas y de señalización de TME. Entre estos componentes, el ácido hialurónico (HA) ha surgido para ejercer un papel crucial en la biología tumoral. A pesar de su simple composición química, HA, junto con sus moléculas de unión HA (hialadherinas), puede modular la angiogénesis, la capacidad de respuesta del sistema inmune y la remodelación de ECM de una manera dependiente del tamaño y la concentración1.

El sistema de complemento (C) también forma parte del TME local, que recientemente ha recibido una atención cada vez mayor. El sistema C abarca un conjunto de proteínas solubles y unidas a membranaimplicadas en la primera línea de defensa contra las no autocélulas, los elementos huésped no deseados y los patógenos. Funcionalmente, la C une los brazos de dos efectos de los sistemas innatos y adaptativos para promover la matanza directa de células o el montaje de una respuesta inflamatoria2. La activación c puede suprimir el crecimiento tumoral, destruyendo las células cancerosas o inhibiendo su crecimiento, pero se ha vuelto cada vez más claro que puede poseer una actividad que promueve el tumor al sostener la inflamación crónica, promoviendo el establecimiento de un ambiente inmunosupresor, induciendo angiogénesis y activando vías de señalización relacionadas con el cáncer3. En este contexto, C1q, la primera molécula de reconocimiento de la vía clásica del sistema C ha surgido para ejercer importantes funciones en el microambiente tumoral independientemente de la activación C4. C1q ha demostrado ser expresado localmente por una gama de tumores malignos humanos, donde puede favorecer laadhesión de las células cancerosas, la migración y la proliferación, además de la angiogénesis y la metástasis 5. Curiosamente C1q interactúa con un componente importante del ECM como HA.

Desarrollamos una técnica para aislar las células cancerosas primarias de la masa tumoral. Además, creamos la matriz, que puede estimular el microambiente tumoral, particularmente la interacción entre C1q y el ácido hialurónico de alto peso molecular. C1q unido a HA fue capaz de inducir la adhesión de las células tumorales.

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Protocolo

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Las muestras de tejido de los pacientes fueron recogidas después del consentimiento informado tras la aprobación de las consideraciones éticas por el Consejo Institucional del Hospital Universitario de Trieste, Italia.

1. Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 1)

  1. Aísle las células del mesotelioma humano de las muestras sólidas de MPM. Picar finamente el tejido con un cortador para obtener fragmentos de aproximadamente 2-3 mm2 de tamaño e incubar en 5 ml de solución de digestión compuesta por la Solución De Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks complementada con 0,5 mM Ca2+/Mg2+,0,5% de trippsina y 50 g/ml DNase I, durante la noche a 4oC.
  2. Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 2)
    1. Después de la incubación durante la noche, coloque el tejido digerido durante 30 minutos en una incubadora de 37 oC con un suave temblor.
    2. Reemplazar la solución de digestión tras la centrifugación (250 x g) por 3 mg/ml de colagenasa tipo 1 disuelta en 5 ml de Medio 199 con HBSS e incubar durante 30 min a 37oC con agitación suave.
    3. Bloquear la reacción enzimática añadiendo un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS). Resuspenda las células con mucho cuidado con una pipeta de 5 ml para asegurarque que la mayoría de las células se liberan del tejido. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro de poros de 100 m.
    4. Sofitee las células en un matraz de 12,5 cm2 y escórmelas a 37 oC con células endoteliales humanas de medio libre de suero (HESF), con 10% de FBS y suplementada con EGF (10 ng/ml), FGF básico (20 ng/ml) y 1% penicilina- estreptomicina.
      NOTA: Reemplace por un medio fresco cada 2-3 días.

2. Recubrimiento HA (Día 1)

  1. Resuspender HA de alto peso molecular (1,5 kDa) en agua destilada doble a la concentración de 1 mg/ml6.
  2. Diluir la solución de material HA a 50 g/ml en tampón de carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) con pipeteo suave.
  3. Recubrir la placa de 96 pocillos con 100 ml de solución de material de HA diluido por pocido durante la noche a 4 oC.
    NOTA: El ácido hialurónico fue un regalo amable del profesor Ivan Donati, Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Trieste7.

3. Recubrimiento C1q (Día 2)

  1. Después de la incubación durante la noche, aspirar los pocillos tratados y lavar la placa de 96 pocillos con 100 ol de PBS de Dulbecco (dPBS) por poca.
  2. Permitir que C1q (25 g/mL o diferentes concentraciones para experimentos de respuesta a la dosis) o BSA (como control negativo) se una núde a plástico inmovilizado-HA incubando estas proteínas a una concentración de 25 g/ml en 100 éL de dPBS + 0,5% de BSA y 0,7 mM Ca2+/Mg2+ . A continuación, incubar durante la noche a 4oC.
  3. Aspirar los pozos y lavar la placa de 96 pocillos con 100 ol/pozo de dPBS.

4. Etiquetado de celdas con FAST DiI

  1. Resuspenda 1 x 105 células tumorales en 500 ml de dPBS que contengan 10 g/ml del tinte fluorescente FAST DiI. Incubar durante 15 min a 37oC en una incubadora de CO2 de 5% v/v para el etiquetado, mezclando manualmente después de 5 min intervalos.
    1. Para eliminar el exceso de FAST DiI, añadir 10 ml de dPBS, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, y centrifugar a 250 x g durante 7 min. Resuspender el pellet celular en 1 mL de medio libre de suero endotelial humano que contenga 0,1% de BSA (HESF + 0,1% BSA).

5. Adhesión celular en matrices HA/C1q (Día 1)

  1. Aspirar los pozos recubiertos con las diferentes matrices (los pozos fueron recubiertos en el paso 3.2).
  2. Distribuir 100 l de la suspensión celular etiquetada a los pocillos recubiertos e incubar la placa durante 35 min a 37 oC en la incubadora de CO2 de 5% v/v.
  3. Retire las células no adherentes aspirando el sobrenadante. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2+ y 0.7 mM Mg2+.
  4. Lise las células adherentes mediante la adición de 200 l / bien de 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1% v / v SDS e inmediatamente leer la placa de 96 pocillos con un lector de fluorescencia (544 nm, emisión 590 nm) utilizando una curva de calibración generada a través de la lisis de un número creciente de etiquetado Células.

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Resultados

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La HA es un polisacárido de alto peso molecular cargado negativamente, que se compone de unidades de disacárido de repetición (1-4)-D-glucurónico-(-,1-3)-N-acetil-D-glucosamina disacárido (Figura1B)7. La aparición de la unión de HA en la placa de 96 pocillos, así como la eficiencia de su inmovilización se probaron aprovechando el HA biotinilado (bio-HA). Las diferentes concentraciones de Bio-HA, que van desde 10 g/ml a 1 mg/ml, se resu...

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Discusión

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Describimos un método fácil para investigar cómo el componente de complemento C1q, interactuando con el ácido hialurónico, es capaz de modular el comportamiento de las células primarias aisladas de los tejidos tumorales humanos. Tanto HA como C1q están abundantemente presentes en el microambiente tisular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, participando en varios procesos biológicos celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que C1q está presente en el microambiente de la placenta, donde favorece la invasión...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos a Ivan Donati por proporcionar ha, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Departamento de Ginecología de IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) y Andrea Romano (Unidad Clínica Operativa de Anatomía e Histología Patológica, Hospital Cattinara, Trieste, Italia ) para la recogida de muestras de tejido. Agradecemos también a Nicolá Morosini por la ayuda en la preparación del video y a Alex Coppola, la voz. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Salud Maternoinfantil, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) y Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100  y micro; m filtro de porosBD Falcon352360
Solución de anfotericina B (fungizona)Sigma-Aldrich 1397-89-3
básico FGFCiencias InmunológicasGRF-15595
Cloruro de calcioSigma-Aldrich C-4901
Colagenasa tipo IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-GlucosaSigma-Aldrich 50-99-7
DNasa I Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich 60-00-4
EGFCiencias InmunológicasGRF-10544
FAST DiISondas moleculares, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Suero fetal bovinoGibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronectinaRoche11051407001
Matraz para cultivo celularCorning430639estéril y ventilada
Sigma-Aldrich G1397-10ML
Hank' s Solución salina equilibrada (HBBS) Sigma-Aldrich H6648Suplementado con EDTA, glucosa, penicilina-estreptamicina, gentamicina y fungizone
Ácido hialurónico de alto peso molecularAmable regalo del Prof. Ivan Donati
libre de suero endotelial humano Gibco,  Thermo Fisher Scientific11111-044Suplementado con EGF (5  ng/mL), FGF básico (10  ng/mL), y  1% de penicilina y ndash; estreptomicina (Sigma-Aldrich)
Cloruro de magnesioCarlo Erba13446-18-9
Medio 199 con Hank' s salSigma-Aldrich M7653
Penicilina-EstreptomicinaSigma-Aldrich P0781
Microscopía time-lapse Nikon Sistema de imagen BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
Trypsin, Sigma-Aldrich T4674
Solución de gentamicina Medio

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

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Etiquetas

Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

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