Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

Summary

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para el proceso de codificación (mRNA) y no codificantes (ncRNA) globina reducida RNA-seq bibliotecas de una muestra de sangre entera sola.

Abstract

La llegada del innovador y cada vez más potentes técnicas de secuenciación siguiente de generación ha abierto nuevos caminos en la capacidad de examinar la expresión de genes subyacentes relacionadas con procesos biológicos de interés. Estas innovaciones no sólo permiten a los investigadores observar la expresión de las secuencias de ARNm que codifican para los genes función celular efecto, pero también las no codificantes (ncRNA) las moléculas de ARN que permanecen sin traducir, pero todavía tienen funciones reguladoras. Aunque los investigadores tienen la capacidad de observar la expresión de mRNA y ncRNA, ha sido habitual para un estudio que se centran en uno o el otro. Sin embargo, cuando los estudios están interesados en la expresión de mRNA y ncRNA, muchas veces utilizan las muestras separadas para examinar la codificación o no-codificación RNAs debido a la diferencia en la preparación de la biblioteca. Esto puede conducir a la necesidad de más muestras que puede aumentar el tiempo, consumibles y el estrés animal. Además, puede causar los investigadores deciden preparar muestras para análisis sólo uno, generalmente el mRNA, limitar el número de cuestiones biológicas que pueden ser investigadas. Sin embargo, ncRNAs abarcan múltiples clases con funciones reguladoras expresión de mRNA de efecto. Porque ncRNA son importantes para los procesos biológicos fundamentales y desorden de estos procesos en durante la infección, por lo tanto, pueden, hacer objetivos atractivos para la terapéutica. Este manuscrito muestra un protocolo modificado para la generación de mRNA y no codificante del RNA expresión bibliotecas, incluyendo el ARN viral, de una sola muestra de sangre entera. Optimización del presente Protocolo, mejora la pureza del RNA mayor ligadura para recuperación de RNAs metilados y omite la selección del tamaño, para permitir la captura de las especies de RNA más.

Introduction

Secuencia de la generación siguiente (NGS) ha surgido como una poderosa herramienta para la investigación de los cambios que ocurren a nivel genómico de organismos biológicos. Preparación de muestras para métodos NGS puede variar dependiendo del organismo, tipo de tejido, y lo más importante las preguntas de los investigadores están deseosos de dirección. Muchos estudios han recurrido a NGS como medio de estudiar las diferencias en la expresión génica entre Estados como individuos sanos y enfermos^1,2,3,4. La secuencia coloque sobre una base ....

Protocol

Protocolos animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de cuidado de animales del Centro Nacional de enfermedad Animal (USDA-ARS-NADC).

1. colección de sangre porcina muestras

1. Obtener muestras de sangre en tubos de RNA. Recoger ~2.5 mL o más si se dispone de tubos más grandes.

2. procesamiento de sangre porcina muestras

1. Centrifugar los tubos de sangre a 5.020 x g por 10 min a temperatura ambiente (15-25 ° C). Si muestras procesamiento congelado incuban el tubo a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 h antes de centrifugar.
2. Eliminar el sobr....

Results

Las muestras representativas en nuestro estudio son la globina y muestras de sangre entera ribo-agotado. El resultado representativo del protocolo consiste en una muestra de biblioteca empobrecido de la globina con un número de la integridad del RNA (RIN) por encima de 7 (figura 1a) y cocientes de concentración 260/280 nm en o por encima de 2 (figura 1b y 1 c). Validación de los resultados de la .......

Discussion

El primer paso crítico en el protocolo que ha optimizado incluye los pasos de agotamiento de la globina añadido, que permite obtener lecturas de calidad de muestras de sangre entera. Una de las más grandes limitaciones sobre el uso de sangre entera en los estudios de secuenciación son los altos números de Lee en la muestra que se asignan a las moléculas de globina y reducirá la lee que puede asignar a otras moléculas de interés¹⁸. Por lo tanto, optimizar el protocolo para nuestro tipo de muestra, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos PAXgene	PreAnalytix	762165
Agua de grado de biología molecular	ThermoFisher	10977-015
mirVana Kit de aislamiento de miARN	ThermoFisher	AM1560
Rneasy MinElute Kit de limpieza	QIAGEN	74204
100% etanol	Decon Labs, Inc.	2716
Tubos de pared delgada de 0,2 mL	ThermoFisher	98010540
tubos sin RNasa/DNasa de 1,5 mL	Cualquier proveedor
Veriti Termociclador de 96 pocillos	ThermoFisher	4375786R
Oligo de reducción de globina (α 1)	Cualquier proveedor		Secuencia GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Reducción de globina Oligo (α 2)	Cualquier proveedor		Secuencia TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Reducción de globina Oligo (β 1)	Cualquier proveedor		Secuencia AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2)	Cualquier proveedor		Secuencia GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hibridación
, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100-KCl
	Millipore Sigma	60142-100ML-F
10X Tampón
-Tris-HCl, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100
-DTT	ThermoFisher	Y00147
-MgCl2	Promega	A351B
-Grado de biología molecular Agua	ThermoFisher	10977-015
RNasa H	ThermoFisher	AM2292
SUPERase-IN	ThermoFisher	AM2694	Inhibidor de la rnasa
EDTA	Millipore Sigma	E7889
Microcentrífuga	Cualquier proveedor
2100 Electroforesis BioAnalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
Agilent ADN de alta sensibilidad  Kit	Agilent Technologies	5067-4626
TruSeq Kit de preparación de biblioteca de ARN total trenzado con Ribo-Zero	Kit	de ARNm Illumina RS-122-2201	; Conjunto Humano/Ratón/Rata A  (48 muestras, 12 índices)
Guía de preparación de muestras de ARN total trenzado TruSeq	Illumina		Disponible en línea
RNAClean XP Beads	BeckmanCoulter	A63987
AMPure XP Beads	BeckmanCoulter	A63880
MicroAmp Tira óptica de 8 tubos	ThermoFisher	N8010580	tubos de pared delgada de 0,2 ml
MicroAmp Tapa de tira óptica de 8 tubos	ThermoFisher	N801-0535
RNasa/DNasa - depósitos de reactivos libres	Cualquier proveedor
SuperScript II Transcriptasa inversa	ThermoFisher	18064-014
MicroAmp Optical Placas de 96 pocillos	ThermoFisher	N8010560	Se utilizaron en lugar de placas de .3 mL según fuera necesario
MicroAmp Película adhesiva óptica	ThermoFisher	4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Set de preparación para Illumina® (Conjunto 1)	Kit de ARN pequeño	E73005	New England Biolabs
NEBNext Multiplex Set de preparación de bibliotecas de ARN pequeñas para Illumina® (Conjunto 2)	New England Biolabs	E75805	kit de ARN pequeño
QIAQuick PCR kit	QIAGEN	28104
96S Super Magnet Plate	ALPAQUA	A001322