Artículo de método

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

DOI:

10.3791/58690

⸱

26 de octubre de 2018

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe el manual de clasificación procedimiento para aislar neuronas fluorescencia etiquetadas solo seguidas en vitro basada en la transcripción ARNm amplificación de la secuencia de RNA de alta profundidad unicelular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular es ahora una herramienta ampliamente implementada para análisis de expresión génica. Disponible en el mercado plataformas de secuenciación del RNA unicelular procesan todo entradas células indiscriminadamente. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación se utiliza a veces, contra la corriente para aislar a una población específicamente etiquetada de interés. Una limitación de FACS es la necesidad de un número elevado de células entradas con fracciones significativamente marcadas, que no es práctico para la recogida y perfiles de poblaciones raras o escasamente marcada neurona del cerebro del ratón. Aquí, describimos un método para manualmente recoger escasa fluorescencia etiquetada neuronas solo de recién disociados tejido de cerebro de ratón. Este proceso permite capturar las neuronas solo etiquetados con pureza elevada y posterior integración con un protocolo en vitro amplificación basada en la transcripción que conserva relaciones de transcripción endógena. Se describe un método de doble amplificación lineal que utiliza identificadores de molécula única (UMIs) para generar cuentas de ARNm individuales. Dos rondas de los resultados de amplificación en un alto grado de detección de genes por célula.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular ha transformado estudios transcriptómico. Mientras que a gran escala unicelular RNAseq puede realizarse usando una variedad de técnicas, como gotitas1,2, microfluídica3, nanogrids4y5de los micropocillos, mayoría de los métodos no puede ordenar tipos celulares definidas expresan fluoróforos genéticamente codificados. Para aislar a una población selecta de la célula, célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación es de uso frecuente para clasificar las células etiquetadas en el modo de una sola célula. Sin embargo, FACS tiene algunas restricciones y requiere de etapas de procesamiento de una muestra. En primer lugar, un gran número de células de entrada es típicamente necesarios (a menudo varios millones células / mL), con una fracción significativa (> 15-20%) que contiene la población marcada. En segundo lugar, preparaciones celulares pueden requerir múltiples rondas de pasos de centrifugación del gradiente de densidad para eliminar la fracción glial, escombros y montones de celulares que de lo contrario podrían obstruir la boquilla o flujo de la célula. En tercer lugar, FACS generalmente emplea la coloración y los pasos para live/dead tinción (por ejemplo, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), yoduro de propidio (PI) y colorantes de Cytotracker), que toman más tiempo de extracción. En cuarto lugar, como regla general para la clasificación (como DAPI y proteína fluorescente verde y rojo (GFP/RFP)), generalmente dos muestras de dos colores y un control son necesarios, que requieren una muestra sin etiqueta para ser procesados además de la cepa de ratón deseado. En quinto lugar, filtrado a menudo se realiza varias veces antes y durante la clasificación de la muestra para evitar proactivamente obstruido muestra líneas en una máquina de FACS. En sexto lugar, debe asignarse tiempo en configuraciones de FACS más comúnmente utilizadas para inicializar y estabilizar el flujo y realizar la calibración de la gota. Séptimo, control de muestras normalmente se ejecutan en secuencia antes de la colección de la muestra real para configurar matrices de compensación, rechazo de doblete, puertas, etc. usuarios o realice los pasos seis y siete se antes de tiempo o requieren la asistencia de un técnico en paralelo. Por último, post-FACS, hay a menudo medidas para asegurar que sólo con la etiqueta solo las células están presentes en cada pozo; por ejemplo, revisando las muestras en una instalación de proyección de alto contenido como un toner de la placa rápida.

Para eludir los pasos descritos arriba y facilitar una relativamente rápida, dirigida la secuencia de una población pequeña de neuronas fluorescencia etiquetadas sola, describimos un manual de clasificación procedimiento seguido por dos rondas de una alta sensibilidad in vitro Protocolo de amplificación, llamado doble transcripción de in vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq). La generación de biblioteca de cDNA y amplificación de RNA está adaptada de Eberwine et al. 6 y Hashimshony et al. 7, con algunas modificaciones para todos los interneurons de ratón que tienen volúmenes celulares más pequeños; Además, también hemos encontrado que es igualmente útil para neuronas piramidales excitatorias.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por la IACUC en laboratorio de Puerto primavera fría, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manual de clasificación de las neuronas de ratón fluorescente etiquetado

  1. Tirar vidrio microcapilares (véase Tabla de materiales) a 10-15 μm de diámetro salida utilizando un extractor capilar con los siguientes ajustes: calor: 508, tirar: en blanco, vel: tiempo en blanco,: en blanco.
  2. Fije el conducto flexible de silicona de 120 – 150 cm (~0.8 mm diámetro interior) un 0,2 μm del polivinilideno (PVDF) de difluoruro jeringa filtro de membrana y una válvula de dos vías tubo usando conectores de tubería adecuada.
  3. Preparar 500 mL de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerada (4 ° C) (ACSF, tabla 1) y oxigeno por burbujea oxígeno 5% dióxido de carbono equilibrado a través de un difusor para 15 minutos o hasta que la solución se aclare completamente.
  4. Preparar 100 mL de ACSF con un cóctel de inhibidores de la actividad en un vaso de precipitados de 150 mL (tabla 1).
  5. Preparar 100 mL de ACSF con 1 mg/mL de proteasa de IV fracción de Streptococcus en un vaso de precipitados de 150 mL (tabla 1).
  6. Preparar 100 mL de ACSF con solución al 1% de suero bovino fetal (FBS) en un vaso de precipitados de 150 mL y oxigenar con 5% de dióxido de carbono equilibrado de oxígeno a través de un difusor.
  7. Diseccionar el cerebro de un ratón eutanasia abriendo el cráneo con una tijera pequeña y extraer el cerebro fresco con unas pinzas finas sin dañar la corteza.
    Nota: Se pueden utilizar ratones de cepa, edad y género como deseado. No congele el cerebro o realizar la clasificación manual en ratones inyectados con virus u otros agentes peligrosos/infecciosos.
  8. Mantener el cerebro en ACSF fría y oxigenada, dejando un difusor atado 5% dióxido de carbono oxígeno de equilibrio durante toda la duración de las secciones.
  9. Colocar el cerebro en el mandril de vibratome y cortar secciones coronales o sagitales a 300 μm de grosor. Recoger tantas secciones como sea necesario para obtener un mínimo de ~ 10-50 etiquetado células hasta varios cientos células. Coloque las rebanadas en un portamuestras de rebanada con malla de algodón, colocado dentro de un vaso de precipitados para están bañadas en oxigenada ACSF.
  10. Colocar rebanadas frescas en un vaso de precipitados que contiene ACSF con bloqueadores de la actividad y el bloque de 15-20 min a temperatura ambiente. Mantenga oxígeno burbujeante con difusor.
  11. Pasar las rodajas a un vaso de precipitados que contiene ACSF con la solución de proteasa a realizar una digestión suave a temperatura ambiente: 20-30 min para P4-14 animales o hasta 45-60 min para animales P28-56. Mantenga oxígeno burbujeante.
  12. Lavar ACSF con proteasa por volviendo a rodajas en el vaso que contiene la ACSF con solución de bloqueo de actividad durante 5 – 10 min a temperatura ambiente. Mantenga oxígeno burbujeante.
  13. Hacia las secciones individuales de un plato de Petri de 100 mm que contiene ACSF con 1% FBS a temperatura ambiente. Bajo un ámbito de disección fluorescente, microdissect áreas y capas de interés tener un mínimo de 10 a 50 células (hasta unos pocos cientos). Realizar la microdisección con un par de Pinzas finas o colocando agujas de inyección 22 – 28 G sobre soportes de madera (brochetas).
  14. Con una pipeta Pasteur, mover las piezas de microdissected a un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contiene mL ~0.8 1% FBS en la solución de la ACSF.
  15. Triturate el tejido disecado en el tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Hacer tres pipetas de Pasteur de tallo largo con la disminución de diámetros de salida rodando sobre una llama abierta. Realizar ~ 10 movimientos con cada pipeta, empezando por los más grandes y terminando con los más pequeños.
  16. Dispensar las células disociadas en un plato de Petri de 100 mm que contiene ACSF oxigenada (placa de Petri puede ser fino recubierto con 5 mm de agar al 1% o silicona transparente compuesto en 1:10 cociente, si se desea). Mantener a temperatura ambiente.
  17. Espera ~ 5-7 min de las células a resolver, entonces gradualmente observe la señal GFP/RFP bajo un microscopio de disección.
    Nota: Las células, residuos y grupos pequeños serán visibles en campo claro (BF).
  18. Recoger las células GFP/RFP de 10-15 a la vez utilizando una pipeta capilar (del paso 1.1) atada tubo de silicona flexible (0.4 – 0.8 mm de diámetro interior) y pipetear las células en un plato de Petri de 100 mm que contiene ACSF oxigenada fresca.
  19. Al bloquear el extremo de la válvula de la tubería con la lengua, coloque el capilar cerca de la celda de interés. Capturar las células mediante acción capilar al aliviar el bloque y rápidamente bloquear otra vez para impedir la entrada de la pipeta de exceso de líquido. Dispensar las células 100 mm plato de Petri con ACSF oxigenada fresca soplando suavemente, mientras observa la punta capilar bajo la óptica de la fluorescencia del microscopio de disección. Objetivo recoger ~ 100-150 células total.
  20. Repita el paso 1.19 una o dos veces más (dependiendo de la suciedad) y la transferencia de un total de 50 – 75 células a un nuevo plato de Petri de 100 mm, asegurándose de que contaminantes tales como residuos son mínimos en la óptica de contraste (DIC) de interferencia diferencial de campo brillante.
  21. Por último, utilizando una pipeta de microcapillary fresca cada vez, seleccione una sola celda en no más de volumen de 0,5 μl y expulsar en un tubo de microcentrífuga de solo 0,2 mL (o una tira de ocho tubos de microcentrífuga de 0.2 mL) que contiene 1 μl de tampón de colección con las cartillas N10B1-N10B96 (tabla 2). Romper la punta de la pipeta en el tubo de microcentrífuga para asegurar que la célula permanece en el búfer de colección. Desechar las pipetas.
  22. Congelar las células colocando tubos en hielo seco y almacenarlos a largo plazo en un congelador de-80 ° C hasta que estén listos para ser procesados para la amplificación de RNA.

2. primera amplificación de RNA redondo

Nota: El siguiente procedimiento es para una franja de ocho tubos de microcentrífuga de 0.2 mL. La escala de las reacciones según sea necesario.

  1. Sintetizar la primera hebra de cDNA (primera vuelta).
    1. Tiras de calor de paso 1.22 a 70 ° c por 5 min seguido de 4 ° c por 5 min; repetir dos veces.
    2. Montar en el hielo de la transcriptasa reversa (RT) master mix/primera-strand síntesis maestro mezcla con los ingredientes siguientes (véase Tabla de materiales): 10 x buffer de primera línea (2 μL), mezcla de dNTP (4 μL), inhibidor de Rnasa (1 μl) y enzima (1 μl).
    3. Centrifugar brevemente la tira en una centrifugadora de mesa a recoger todo en la parte inferior. Mantener en hielo.
    4. Añadir 1 μl de la mezcla principal de master mix/primera-strand síntesis RT en los tubos anteriores (total de volumen de 1 μl del tampón de muestra de recolección de células + 1 μl de RT = 2 μl/tubo). Mezclar por pipeteo. Girar brevemente para recoger todo el contenido en la parte inferior y mantenerla en hielo.
    5. Incubar el tubo/s superior a 42 ° C por 2 h en un horno de aire. Poner los tubos en hielo inmediatamente al terminar la reacción y continúe con el paso de la síntesis del segundo filamento.
  2. Sintetizar la segunda cadena de cDNA (primera vuelta).
    1. Hacer segundo filamento principal mezcla (80 μL) en el hielo en el siguiente orden en un tubo de 1,5 mL: agua libre de nucleasas (63 μL), 10 x segundo buffer de filamento (10 μl), mezcla de dNTP (4 μL), polimerasa de la DNA (2 μL) y RNaseH (1 μl). Mezclar los ingredientes bien en Vortex y luego vuelta a recoger en la parte inferior y mantener en hielo.
    2. Inicio El termociclador, ejecutar el siguiente programa para pre-enfriar la unidad, estar listo para comenzar a paso 2.2.3 (calor de la tapa = off; 16 ° C por 2 h, 4 ° C hold) y detener a 16 ° C.
    3. Añadir una faja 80 μl o 10 μl/tubo de segundo filamento maestro mezcla de cada tubo de la franja y mantener en hielo. Transferencia de la tira en el termociclador y reanudar el paso de 16 ° C Iniciado por encima. Incubar la franja por 2 h a 16 ° C.
    4. Después del paso de la síntesis del segundo filamento, coloque los tubos en hielo para proceder al siguiente paso de purificación de cDNA.
  3. Purificar el cDNA trenzado doble (primera vuelta).
    Nota: Se realizan todos centrifugados a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Nunca superar los 16.000 x g para evitar dañar el cartucho del filtro.
    1. Comienza a calentar 100 μl de agua libre de nucleasa a 50 – 55 ° C para su uso posterior en un bloque de la calefacción en seco. Nunca superar los 58 ° C para evitar la desnaturalización parcial del cDNA.
    2. Añadir 250 μl de tampón de Unión cDNA a un tubo de 1,5 mL. Compruebe para precipitados en el buffer, luego calentar la solución tampón a 37 ° C por 10 min volver a disolver precipitados.
    3. Transferencia de cDNAs de una sola tira de tubo de 8 en el búfer de atascamiento de cDNA. Combinar las celdas de este paso para otros procesos posteriores (8 células en el 1 tubo). Mezclar cuidadosamente por 2 - 3 veces el pipeteo y sacudiendo 3 - 4 veces. Vuelta para recoger el contenido en la parte inferior.
    4. Ponga el cartucho de filtro de cDNA en tubos de lavado (de un kit de transcripción (IVT) en vitro ) firmemente. Añadir la mezcla anterior en el centro del filtro. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que esté a través del filtro. Deseche el flujo a través y reemplazar el tubo de lavado.
    5. Añadir 500 μl de tampón de lavado desde el kit de la IVT a la columna.
      Nota: Asegúrese de que etanol ha sido añadido a la solución de lavado previamente.
    6. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que esté a través del filtro. Deseche el flujo y centrifugar nuevamente a 8.000 g x ~ 1 min vaciar el cartucho.
    7. Transferir el filtro de cDNA de un cDNA elución (un tubo 1,5 mL libre de nucleasas). Aplica 8,5 μl de agua libre de nucleasa precalentado al centro del filtro. Espere 2 minutos y centrifugar a 8.000 x g de ~1.5 min.
    8. Otra vez eluir con 8,5 μl de agua libre de nucleasa precalentado y proceder inmediatamente a la primera ronda de IVT.
      Nota: El volumen de recuperación de cDNA de doble hebra será ~ 16 μl.
  4. Realizar una reacción de transcripción (IVT) en vitro para la producción de RNA (aRNA) amplificación de cDNA (primera vuelta).
    1. Programar el horno de aire de hibridación a 37 ° C.
    2. Preparar la mezcla principal para IVT sobre hielo en el siguiente orden: a 16 μl de cDNA de doble hebra eluída de paso 2.3.8, añadir 4 μL de solución de ATP T7 (75 mM); 4 μL de solución CTP T7 (75 mM); 4 μL de solución GTP T7 (75 mM); 4 μL de solución UTP T7 (75 mM); 4 μL de tampón de reacción 10 x T7; y 4 μL de mezcla de enzima T7. Mezclar bien, girar y mantener en hielo.
    3. Añadir 24 μl de la mezcla principal de IVT a cada tubo que contiene 16 μl de cDNA. Mezcle el contenido mediante pipeteo suave y minuciosamente. Incubar el tubo a 37 º C durante 14 h.
      Nota: Incubación < 12 h afecta seriamente el rendimiento.
    4. Añadir 60 μL de no-dietil pirocarbonato (no con DEPC) tratamiento agua libre de ARNasa para aumentar el volumen a 100 μl y detener la reacción de IVT.
  5. Purificar el aRNA.
    Nota: Se realizan todos centrifugados a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Nunca superar los 16.000 x g para evitar dañar el cartucho del filtro.
    1. Comienza a calentar ~ 200 μL de agua libre de nucleasa a 50 – 55 ° C para su uso posterior en el bloque de la calefacción en seco o máquina PCR. Nunca superar los 58 ° C para evitar la desnaturalización parcial de aRNA.
    2. ARNA de transferencia a un tubo de 1,5 mL libre de nucleasas. Añadir 350 μl de tampón de Unión aRNA a cada muestra de aRNA. Añadir 250 μl de etanol al 100% a cada tubo y mezcle por 3 veces por pipeteo (do no agitar con vortex para mezclar y centrifugar).
    3. Transferir inmediatamente la mezcla a la columna de purificación de RNA añadiendo suavemente al centro del cartucho del filtro. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que la mezcla ha pasado completamente a través del filtro. Deseche el flujo a través y reutilizar el tubo de recogida de residuos
      Nota: RNA comenzará a precipitar en la adición de etanol.
    4. Añadir 650 μl de tampón de lavado para cada cartucho de filtrado. Centrífuga para min ~ 1 a 8.000 x g o hasta que el búfer todo ha pasado. Deseche el flujo a través y gire los filtros para una adicional ~ 1 min eliminar los restos de la solución de lavado.
    5. Transferir el filtro a un tubo de colección de frescos de aRNA. Añadir 100 μl de agua libre de nucleasa de (50-55 ° C) precalentado al centro del filtro. Esperar 2 minutos, entonces centrifugar ~1.5 min a 8.000 x g o hasta que haya pasado en el tubo de colección.

3. segunda ronda de amplificación

  1. Sintetizar el cDNA de cadena primera (segunda ronda).
    1. Transferencia de aRNA de paso 2.5.5 a un tubo de microcentrífuga de 200 μl y vacío concentrarse el elutant a 10 μl. no utilizando calentamiento, el concentrador de vacío de 65 minutos en comparación con 10 μl de agua en un tubo de 200 μL para estimar el volumen reducido de 100 μl.
    2. Precalentar el horno de aire de hibridación a 42 ° C.
    3. Añadir 2 μl de random hexamer primers del kit del IVT a aRNA, vortex brevemente y vuelta para recoger el contenido.
    4. Incubar el tubo de microcentrífuga a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador, luego coloque en hielo.
    5. Preparar la siguiente mezcla master RT: 2 μl de 10 x primer almacenador intermediario de síntesis de strand, 4 μL de mezcla de dNTP, 1 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de enzima ArrayScript. Mezcla bien en un tubo de microcentrífuga μl 200 por Vortex suavemente, luego gira para recoger el contenido y coloque en hielo.
    6. Añadir 8 μl del master RT mix (primera línea) a cada tubo de microcentrífuga. Colocar los tubos en una incubadora de aire de 42 ° C por 2 h.
    7. Añadir 1 μl de RNaseH a la reacción anterior. Mezcla bien por 2 - 3 veces el pipeteo y agitando 3 - 4 veces y vuelta a recoger el contenido. Incubar a 37 ° C por 30 minutos en una máquina PCR. Después de la incubación, continúe con el paso de la síntesis del segundo filamento inmediatamente.
  2. Sintetizar la segunda cadena de cDNA (segunda ronda).
    1. Agregar 3 μl de cebador T7-RA5 (en dilución trabajo de 25 ng/μl, tabla 2) y 2 μl de agua libre de ARNasa a cada muestra de cDNA. Mezclar bien y centrifugar para recoger el contenido.
    2. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador. Lugar la reacción en hielo.
    3. Preparar el maestro RT (segunda parte) de la mezcla en hielo: 58 μl de agua libre de nucleasa, 10 μl de 10 x segundo buffer de strand, 4 μL de mezcla de dNTP y 2 μl de ADN polimerasa. Mezclar por Vortex y centrifugar para recoger el contenido. Mantener en hielo.
    4. Añadir 74 μl de la mezcla anterior a cada tubo de paso 3.2.2. Mezclar por pipeteo de 2 – 3 veces y agitando 3 - 4 veces, luego para recoger el contenido. Mantener en hielo y mantenga.
    5. Pre-enfriar al termociclador a 16 ° C apagando el calor de la tapa. Colocar los tubos en el termociclador durante 2 horas a 16 ° C.
    6. Después del paso de la síntesis del segundo filamento, coloque los tubos en hielo para continuar con el paso de la purificación de cDNA, o congelar a-20 ° C.
      Nota: purificación de cDNA se recomienda antes de congelarlos.
  3. Realizar la purificación de cDNA (segunda ronda).
    Nota: Se realizan todos centrifugados a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Nunca superar los 16.000 x g para evitar dañar el cartucho del filtro.
    1. Comienza a calentar el agua libre de nucleasa a 50 – 55 ° C para su uso posterior en un bloque de la calefacción en seco. Nunca superar los 58 ° C para evitar la desnaturalización parcial del cDNA.
    2. El cDNA de transferencia a un tubo de 1,5 mL libre de nucleasas. Añadir 250 μl de tampón de Unión cDNA a cada tubo. Verifique precipitados en el búfer y calentar la solución tampón a 37 ° C por 10 min volver a disolver. Mezclar cuidadosamente por 2 – 3 veces el pipeteo y sacudiendo 3 - 4 veces. Vuelta para recoger el contenido.
    3. Poner firmemente el cartucho del filtro de ADNc en los tubos de lavado. Añadir la mezcla anterior en el centro del filtro. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que esté a través del filtro. Deseche el flujo a través y reemplazar el tubo de lavado.
    4. Añadir 500 μl de tampón de lavado. Asegúrese de que el etanol ha sido añadido a la solución de lavado previamente. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que esté a través del filtro.
    5. Deseche el flujo a través y centrifugar nuevamente a 8.000 x g ~ 1 min vaciar el cartucho. Transferir el filtro de cDNA en un tubo de elución de cDNA.
    6. Aplica 8,5 μl de agua libre de nucleasa precalentado al centro del filtro. Espere 2 minutos y centrifugar a 8.000 g x min ~1.5 Elute nuevo con adicional 8,5 μl de agua libre de nucleasa precalentado.
      Nota: El volumen de recuperación de cDNA de doble hebra será ~ 16 μl.
    7. Proceder inmediatamente a la segunda ronda de IVT o congelar el cDNA a-20 ° C durante la noche.
  4. Realizar una segunda ronda de la producción de aRNA de IVT.
    1. Conjunto horno de hibridación aire a 37 ° C (36 ° C punto de ajuste).
    2. Preparar la mezcla principal para IVT sobre hielo en el siguiente orden: a 16 μl de cDNA de doble hebra eluída de paso 3.3.7, añadir 4 μL de solución de ATP T7 (75 mM); 4 μL de solución CTP T7 (75 mM); 4 μL de solución GTP T7 (75 mM); 4 μL de solución UTP T7 (75 mM); 4 μL de tampón de reacción 10 x T7; y 4 μL de mezcla de enzima T7. Mezclar bien, girar brevemente para recoger el contenido y mantener en hielo.
    3. Añadir 24 μl de la mezcla principal de IVT a cada tubo que contiene 16 μl de cDNA. Mezcle el contenido mediante pipeteo suave y minuciosamente. Incubar el tubo a 37 º C durante 14 h.
      Nota: < 12 h incubación afecta gravemente rendimiento.
    4. Añadir 60 μL de DEPC no tratada agua libre de ARNasa para aumentar el volumen a 100 μl y detener la reacción de IVT.
  5. Realizar la purificación de aRNA (segunda ronda).
    Nota: Se realizan todos centrifugados a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Nunca superar los 16.000 x g para evitar dañar el cartucho del filtro.
    1. Comienza a calentar ~ 200 μL de agua libre de nucleasa a 50 – 55 ° C para su uso posterior en el bloque de la calefacción en seco o máquina PCR. Nunca superar los 58 ° C para evitar la desnaturalización parcial de la aRNA.
    2. Transferir la aRNA a un tubo de 1,5 mL libre de nucleasas. Añadir 350 μl de tampón de Unión aRNA a cada muestra de aRNA. Añadir 250 μl de ACS grado 100% de etanol a cada tubo y mezclar 3 veces por pipeteo (do no agitar con vortex para mezclar y centrifugar).
      Nota: RNA comenzará a precipitar en la adición de etanol.
    3. Transferir inmediatamente la mezcla a la columna de purificación de RNA añadiendo suavemente al centro del cartucho del filtro. Centrifugue a 8.000 x g ~ 1 min o hasta que la mezcla ha pasado completamente a través del filtro. Deseche el flujo a través y reutilizar el tubo de recogida de residuos.
    4. Añadir 650 μl de tampón de lavado para cada cartucho de filtrado. Centrífuga para min ~ 1 a 8.000 x g o hasta que el búfer todo ha pasado. Deseche el flujo a través y gire los filtros para una adicional ~ 1 min eliminar los restos de la solución de lavado.
    5. Transferencia de los filtros a un tubo de colección de frescos de aRNA. Añada 100 μl de agua libre de nucleasa precalentado al centro del filtro. Esperar 2 minutos, entonces centrifugar ~1.5 min a 8.000 x g o hasta que haya pasado.
    6. Alícuota 2 μL en un tubo de espectrofotómetro (en longitud de onda de 260 nm) y equipo bioanalyzer difundir análisis para verificar la calidad y el rendimiento de aRNA.
      Nota: La concentración debe ser al menos de 5 ng/μl; en caso contrario, rechazar la muestra. La muestra puede almacenarse para ~ 1 año a-80 ° C. Evitar congelar-descongelar las muestras.
    7. Compruebe las muestras usando un equipo bioanalyzer a visualizar la propagación adecuada de aRNA productos siguiendo el protocolo del fabricante (figura 2).

4. amplifica la fragmentación del ARN y la limpieza

  1. Mezcla lo siguiente en el hielo (volumen total 40 μl, combine 2 tubos aRNA no superpuestos muestra de códigos de barras): 36 μl de aRNA (total de 200 ng) y 4 μL de tampón de fragmentación de RNA. Incubar la mezcla a 94 ° C por 90 s.
  2. Inmediatamente mueva la mezcla de hielo y añadir 4 μL de tampón de parada de fragmentación de RNA. Ajustar el volumen a 100 μl añadiendo 56 μl de agua libre de nucleasa.
  3. Añadir 350 μl de tampón de la RLT de la purificación del ARN de kit (véase Tabla de materiales) y mezclar por pipeteo. Añadir 250 μl de EtOH, mezclar bien mediante pipeteo y transferir la muestra a la columna de spin de purificación de RNA. Centrifugado de 15 s a 8.000 x g.
  4. Transferir la columna al nuevo tubo y agregar 500 μl de tampón RPE. Centrifugado de 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo a través. Agregar 500 μl de 80% EtOH y centrifugado por 2 min a 8.000 x g.
  5. Transfiera la columna a un tubo nuevo de colección, abra la tapa de la columna y centrifugado durante 5 minutos a toda velocidad.
  6. Transfiera la columna a un tubo de colección nuevo y eluir con 16 μl de agua libre de nucleasa, girando a toda velocidad durante 1 minuto.

5. Biblioteca preparación

Nota: Fianzas pueden combinarse en este punto, si no hay ninguna superposición de códigos de barras utilizados. El tiempo de tratamiento de fosfatasa es tiempo de 40 min. poli-nucleótido quinasa 1 h.

  1. A 16 μl de aRNA fragmentado en un tubo PCR de 0,7 mL, añadir 4 μL de la mezcla siguiente: 2 μl de 10 x buffer de fosfatasa, 1 μl de fosfatasa Antártica y 1 μl de inhibidor de la ribonucleasa recombinantes (por ejemplo, RNaseOUT). Incubar en un termociclador con el siguiente protocolo: 37 ° C durante 30 min, 65 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C.
  2. En el tubo PCR de 0,7 mL en el paso 5.1, Añadir 30 μl de la mezcla siguiente: 17 μl de agua libre de nucleasas y 5 μl de 10 x buffer de fosfatasa, 5 μl de ATP (10 mM), 1 μl de inhibidor de la ribonucleasa recombinante 2 μl de PNK. Incubar en el termociclador a 37 ° C durante 60 min, a continuación, mantener a 4 ° C.
  3. Realizar una limpieza de columna de fosfatasa y PNK-tratado aRNA.
    1. Ajustar el volumen a 100 μl por añadiendo 50 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 350 μl de tampón de RLT y mezclar bien. Añadir 250 μl de EtOH, mezclar bien mediante pipeteo y transferir la muestra a la columna de spin de purificación de RNA.
    2. Centrifugado de 15 s a 8.000 x g. transfiera la columna a un tubo de colección nuevo y agregar 500 μl de tampón RPE.
    3. Centrifugado de 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo a través y agregar 500 μl de 80% EtOH.
    4. Centrifugado por 2 min a 8.000 x g. traslado de la columna a un tubo nuevo de colección, abra la tapa de la columna y centrifugado durante 5 minutos a toda velocidad.
    5. Transfiera la columna a un tubo de colección nuevo y eluir con 14 μl de agua libre de nucleasa, girando a toda velocidad durante 1 minuto recuperar un ~ 10 μl volumen de material. Deseche el columna. Reducir el volumen a 5 μl utilizando un concentrador de vacío durante aproximadamente 10 minutos.
  4. Ligar un 3' kit de adaptador con un comercial (véase Tabla de materiales).
    1. Diluir 3' adaptador (RA3) de pliegues de kit 3 TrueSeq con agua libre de nucleasas y almacenar las alícuotas a-20 ° C.
    2. A 5 μl de fosfatasa y ARN tratados con PNK, añadir 1 μl del diluido 3' adaptador. Incubar a 70 ° C por 2 min y luego coloque inmediatamente el tubo en hielo para evitar la formación de la estructura secundaria.
    3. Añadir 4 μL de la mezcla siguiente: 2 μl de 5 x buffer de la ligadura de la HM (HML), 1 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de ligasa de T4 RNA 2 (truncado). Incubar los tubos en el termociclador precalentado a 28 ° C durante 1 hora (o con la tapa abierta).
    4. Con el tubo de reacción en el termociclador, añadir 1 μl de solución de parada (STP) y suavemente pipetear el volumen entero hacia arriba y hacia abajo de 6 – 8 veces para homogeneizar. Seguir a incubar el tubo de reacción en el termociclador a 28 ° C durante 15 minutos, luego coloque el tubo en hielo.
    5. Agregar 3 μl de agua libre de nucleasa para obtener un volumen total de 12 μl. uso 6 μl y almacenar los restantes 6 μl a-80 ° C.
  5. Llevar a cabo una reacción de transcripción reversa.
    1. Combinar los siguientes en un tubo PCR: 6 μl de RNA adaptador ligarse y 1 μl de cebador de RNA RT (RTP). Incubar el tubo a 70 ° C por 2 min, luego coloque inmediatamente el tubo en hielo.
    2. Agregar 5.5 μl de la mezcla siguiente: 2 μl de 5 x buffer strand primera, 0.5 μl de mezcla de dNTP de 12,5 mM, 1 μl de 100 mM DTT, 1 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de transcriptasa reversa. Incubar los tubos en el termociclador precalentado a 50 ° C durante 1 hora, luego coloque el tubo en hielo (muestras pueden conservarse a-20 ° C).
  6. Realizar la amplificación por PCR con los ciclos de 11-15 para enriquecer 5', producto ligados 3'-primer.
    1. Para cada reacción de transcripción reversa, añadir 35,5 μl de la mezcla siguiente: 8,5 μl de agua ultra pura, 25 μl de la mezcla PCR (PML) y 2 μl de cebador de RNA PCR (RP1). A cada reacción, añadir 2 μl de un primer de RNA PCR únicamente indexada (RPIX, X = 1-24).
    2. Amplificar el tubo en el termociclador con las siguientes condiciones de ciclo de PCR: 98 ° C por 30 s; ciclos de 12-15 de 98 ° C durante 10 s; 60 ° C a 30 s; 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 10 min; luego mantener a 4 ° C.

6. PCR producto limpieza y selección del tamaño

  1. Precalentamiento AmpureXP bolas magnéticas a temperatura ambiente. Vórtice los granos hasta que estén bien dispersos, añada 50 μL para la reacción de PCR de 50 μl (1:1 PCR producto: granos). Mezclar el contenido de diez veces para homogeneizar.
  2. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min lugar sobre un soporte magnético para por lo menos 5 minutos, hasta que el líquido aparezca claro. Retire y deseche el 95 μl del sobrenadante.
  3. Añadir 200 μL de recién preparado 80% EtOH. Incubar durante al menos 30 s, luego retire y descarte el sobrenadante sin molestar a los granos. Repita esto una vez más.
  4. Deje secar al aire los granos para 15 minutos o hasta que seque completamente. Resuspender con 32,5 μl de buffer de resuspensión. Pipetear el volumen entero arriba y abajo 10 veces para mezclar bien.
  5. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min lugar sobre un soporte magnético durante 5 min., hasta que el líquido aparezca claro. Transferencia 30 μL del sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir 20 μl de agua libre de nucleasa para obtener un volumen total de 50 μl.
  6. Realizar la selección del tamaño de los productos PCR con bolas magnéticas de fase sólida inmovilización reversible (SPRI).
    1. Añadir 0,7 x volumen (35 μL) de granos de la SPRI al tubo preparado en paso 6.5 y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    2. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere por 5 minutos o hasta que los granos separados. Retire con cuidado el sobrenadante sin molestar a los granos.
    3. Añadir 200 μL de recién preparado 85% EtOH. Esperar 30 s, después quite el EtOH. Deje secar al aire los granos para 10 minutos.
  7. Añadir 20 μl de agua libre de nucleasa. Coloque el tubo en el imán, espere 5 minutos y pipeta de la porción líquida y sin alterar ni tocar los granos. Guardar el ADN a-20 ° C.

7. determinación de la calidad y cantidad de biblioteca

  1. Compruebe la concentración de ADN con un espectrofotómetro a longitud de onda de 260 nm (espera que la concentración es al menos de ~ 5-10 ng/μL).
  2. Ejecutar 1 μl de cada muestra en un equipo bioanalyzer usando un chip de ADN de alta sensibilidad para examinar la distribución de tamaño (espera que máximo es 300 – 400 bp (ver figura 3)).

8. muestra presentación

  1. Combinar códigos de barras PCR secuenciación no superpuestos (proporción 1:1). Por ejemplo, combinan productos PCR de muestras RPI-1 y 2 RPI, RPI-3 RPI-4 en cantidades de nanogramos igual cada, según el ARN secuencias entrada total de la muestra cantidad requisito recomendaciones de principales.
  2. Después de combinar, ajustar la concentración total a 5 ng/μl y al menos un volumen de 10 μl o como recomendada por el núcleo de instalación de la secuencia.

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Resultados

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Utilizando el protocolo descrito, GABAergic neuronas fueron manualmente ordenadas (figura 1) y RNA fue amplificado, hecho en una biblioteca de cDNA (figura 2) y secuenciado en profundidad8. Los productos amplificados de RNA (aRNA) oscilaron entre 200 – 4.000 bp en tamaño, con una distribución de pico ligeramente por encima de 500 bp (Figura 3A). La biblioteca de cDNA de grano ...

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Discusión

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El manual de clasificación de protocolo es adecuado para una secuencia de RNA supervisada de neurona las poblaciones que son escasamente marcados en el cerebro de ratones o representan a una población de células raras que de lo contrario no es factible estudiar con células de alto rendimiento actual métodos de selección y amplificación. Las células sometidas a FACS generalmente se someten a las presiones de línea de vaina y muestra en la gama de ~ 9 – 14 psi, dependiendo del tamaño de la boquilla y deseado de las tasas d...

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Divulgaciones

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Autores declaran que no hay ninguna competencia intereses financieros.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH (5R01MH094705-04 y R01MH109665-01 a Z.J.H.), por el CSHL Robertson Neurociencia fondo (Z.J.H.) y por una beca Post-Doctoral de NARSAD (a A.P.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mezclas de control de espiga de ARN ERCCThermo FisherCat# 4456740
SuperScript IIIThermo FisherCat# 18080093
RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasaThermo FisherCat# 10777019
Tampón de fragmentación de ARNEngland BiolabsCat# E6105S
Kit RNA MinEluteQiagenCat# 74204
Fosfatasa antárticaNew England BiolabsCat# M0289
Polinucleótido quinasaNew England BiolabsCat# M0201
T4 RNA ligasa2, truncadoNew England BiolabsCat# M0242
Ampure Xp magnético  perlasBeckman CoulterCat# A63880
SPRIseleccionar tamaño selección de perlasmagnéticasThermo FisherGato# B23317
DL-AP5TocrisGato# 0105
CNQXTocrisGato# 1045
TTXTocrisGato# 1078
Proteasa de Streptomyces griseusSigma-AldrichGato# P5147
Mensaje Kit Amp IIThermo FisherCat# AM1751
CarbogenAirgasCat# UN3156
Sylgard 184Sigma-AldrichCat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNAkit IlluminaCat# RS-200-0012
Bioanalizador RNA Pico chipAgilentCat# 5067-1513
Bioanalizador Chip de ADN de alta sensibilidadAgilentCat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100Agilent
Microscopio de disección con fluorescencia e iluminación de campo claro con óptica DIC. (Leica modelo MZ-16F).LeicaModelo MZ-16F
Microcapilar de vidrio: Tubos capilares de borosilicato 500/paquete. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, pared= 0,21 mm, Longitud= 150 mm.Warner instrumentsModelo GC100-15, Pedido # 30-0017
Extractor de pipetas capilaresSutter Instruments CoP-97
VibratomeThermo MicromHM 650V
Unidad de enfriamiento de tejidosVibratome Thermo MicromCU 65
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Referencias

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  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
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