Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

Aleksandra Skrajna; Xiao-Cui Yang; Zbigniew Dominski

doi:10.3791/58697

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Artículo de método

Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

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DOI:

10.3791/58697

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3 de enero de 2019

Aleksandra Skrajna¹ , Xiao-Cui Yang¹ , Zbigniew Dominski¹^,²

¹Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Resumen

Durante muchos años, la interacción excepcionalmente fuerte y rápidamente formada entre biotina y estreptavidina se ha utilizado con éxito para la purificación parcial de complejos RNA/proteína biológicamente importantes. Sin embargo, esta estrategia sufre una importante desventaja que limita su utilización más amplia: la interacción de la biotina/estreptavidina se puede romper solamente bajo desnaturalizar condiciones que también alteran la integridad de los complejos eluídas, de ahí que su Análisis funcional posterior y posterior purificación por otros métodos. Además, las muestras eluídas con frecuencia están contaminadas con las proteínas de fondo que un asocian con estreptavidina granos, que complica el análisis de los complejos purificados por plata y espectrometría de masas. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una variante de la estrategia de biotina/estreptavidina biotina se une a un sustrato de RNA mediante un enlazador foto escindibles y los complejos inmovilizados en cuentas de estreptavidina se eluyen selectivamente a la solución en un forma nativa por onda larga UV, dejando las proteínas de fondo en las cuentas. Cortos sustratos de enlace de RNA pueden ser sintetizados químicamente con biotina y el vinculador foto escindibles covalentemente atado extremo 5' del ARN, mientras que los dos grupos pueden proporcionar sustratos de RNA más largo por un oligonucleótido complementario. Estas dos variantes del método UV-elución fueron probadas para la purificación de los complejos de procesamiento de RNPnp dependiente U7 que cleave pre-mRNAs de las histonas en el extremo 3' y ambos probaron a comparar favorablemente con otros previamente desarrollado métodos de purificación. Eluyen de UV de las muestras contuvieron cantidades fácilmente detectables de la RNPnp U7 que era libre de contaminantes de la proteína importante y conveniente para el análisis directo por espectrometría y análisis funcionales. El método descrito puede ser fácilmente adaptado para la purificación de otros complejos de unión de la RNA y utilizado conjuntamente con sitios de unión de ADN de hebra simple y doble para purificar DNA específico proteínas y complejos macromoleculares.

Introducción

En eucariotas, precursores de ARN polimerasa II genera ARNm (pre-mRNAs) se someten a varios eventos de maduración en el núcleo antes de ser completamente funcional plantillas de mRNA para la síntesis de proteínas en el citoplasma. Uno de estos eventos es el 3' final de procesamiento. Para la mayoría de los pre-mRNAs, 3' extremo proceso de elaboración es escote juntada a poliadenilación. Esta reacción de dos etapas es catalizada por un complejo relativamente abundante que consta de más de 15 proteínas¹. Histona dependiente de replicación animal pre-mRNAs se procesan en el extremo 3' por un mecanismo diferente en la que el papel es interpretado p....