Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

Summary

Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.

Abstract

Para simular la infección por Cryptococcus, la ameba, que es el depredador natural de las células criptocócicas en el entorno, se puede utilizar como modelo para macrófagos. Este organismo depredador, similar a los macrófagos, emplea fagocitosis para matar las células internalizadas. Con la ayuda de un microscopio de exploración láser confocal, se capturan imágenes que representan momentos interactivos entre las células criptocócicas y la ameba. La potencia de resolución del microscopio electrónico también ayuda a revelar el detalle ultraestructural de las células criptocócicas cuando están atrapadas dentro de la vacuola de alimentos de la ameba. Dado que la fagocitosis es un proceso continuo, los datos cuantitativos se integran en el análisis para explicar lo que sucede en el momento en que se captura una imagen. Para ser específicos, se leen unidades de fluorescencia relativa para cuantificar la eficiencia de la ameba en la internalización de las células criptocócicas. Para este propósito, las células criptocócicas se tiñen con un tinte que las hace fluorescencia una vez atrapadas dentro del ambiente ácido de la vacuola alimentaria. Cuando se utiliza en conjunto, la información recopilada a través de estas técnicas puede proporcionar información crítica para ayudar a sacar conclusiones sobre el comportamiento y el destino de las células cuando se internalizan por la ameba y, posiblemente, por otras células fagocíticas.

Introduction

Los microbios han evolucionado con el tiempo para ocupar y prosperar en diferentes nichos ecológicos como los límites físicos abiertos del suelo y el agua, entre otros¹. En estos nichos, los microbios a menudo participan en la competencia directa por recursos limitados; importante, para los nutrientes que utilizan para apoyar su crecimiento o espacio,que necesitan para acomodar a la población en expansión 2,³. En ciertos casos, algunos organismos holozoicos como la ameba pueden incluso ser anteriores a las células criptocócicas como una forma de extraer nutrientes de su biomasa

Protocol

Cryptococcus neoformans y algunas cepas de Acanthamoeba castellanii se consideran patógenos de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2); por lo tanto, los investigadores deben tomar las precauciones adecuadas al trabajar con estos organismos. Por ejemplo, el personal de laboratorio debe tener capacitación específica y equipo de protección personal (EPP) como abrigos de laboratorio, guantes y protección ocular. Se debe utilizar un armario de seguridad biológico (nivel 2) para procedimientos que puedan causar infección^14.

1. Cultivo y estandarización de células fúngicas (modificadas a partir de Madu et al.

Results

Los microbios son organismos microscópicos que no se pueden percibir a simple vista. Sin embargo, su impacto puede resultar en enfermedades observables clínicamente evidentes, como infecciones de la piel. Al estudiar ciertos aspectos de los microbios, que van desde su morfología, subproductos e interacciones, ser capaz de proporcionar evidencia pictórica y de vídeo es de suma importancia.

Primero buscamos visualizar la interacci.......

Discussion

En el documento, se emplearon con éxito diferentes técnicas para revelar el posible resultado que puede surgir cuando la ameba interactúa con las células criptocócicas. También, estábamos interesados en mostrar los efectos de los ácidos grasos 3-hidroxi en el resultado de las interacciones Cryptococcus-amoeba.

La primera técnica utilizada fue la microscopía confocal, que representaba imágenes fijas. El principal inconveniente de esta técnica aquí fue que sólo nos dio información que s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de plástico de 1,4-diazabiciclo-[2.2.2]-octano	Sigma-Aldrich	D27802-1,5
mL	Thermo Fisher Scientific	69715-15
mL	Thermo Fisher Scientific		de
7252018 de 50 ml	Portaobjetos de cámara Thermo Fisher Scientific		1132017-8
pocillos	Thermo Fisher Scientific
1109650-acetona	Merck		SAAR1022040LC-Ameba
cepa	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC medio 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba medio
Placa de microtitulación negra de 96 pocillos	Termo Fisher Scientific
152089-Centrífuga	Hermle	-	-
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432-Microscopio
confocal	Nikon	Nikon Nikon TE 2000-Resina
epoxi:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS[	2] R1073	-
[3] ERL Y221	resina[3] ALS[	3] R1047R	-
[4] S1 (2-dimetilaminoetanol)	[4] ALS	[4] R1067-Isotiocianato	de
fluoresceína	Sigma-Aldrich	F4274-Ácido
fórmico	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C Lector de	microplacas
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-Glutaraldehído
	ALS	R1009	-
Hemocitómetro	Boeco	-	-
Citrato de plomo	ALS	R1209-Cromatografía
líquida Espectrómetro de masas	Thermo Fisher Scientific-Methanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Agitador
orbital	Lasec	-	-
Tetróxido de osmio	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	Este es el tinte sensible al pH
Solución tampón fisiológica	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Agitador
rotativo	Labcon	-	-
Tampón de fosfato de sodio:
[1] ortofosfato de hidrógeno disódico dihidratado	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] dihidrógeno di-hidrógeno dihidrato de sodio	[2] Merck	[2] 106345
Microscopio electrónico de transmisión	Philips	Philips EM 100	-
Azul de tripán	Sigma-Aldrich	T8154-Ultramicrótomo
	Leica	EM UC7-Acetato
uranilo	ALS	R1260A-Desecador	de
vacío	Lasec	-	-
Vial	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec	239210-YPD
agar	Sigma-Aldrich	Y-1500	-