Investigación de las dependencias genéticas usando análisis CRISPR Cas9 basado en competencia

Resumen

Este manuscrito describe un método de CRISPR Cas9 basado en cluster regularmente otro corto palindrómico repite (CRISPR) simple y expedita investigación del papel de varios genes candidatos en la proliferación de células de leucemia mieloide aguda (AML) en paralelo. Esta técnica es escalable y puede ser aplicada en otras líneas celulares de cáncer así.

Resumen

Estudios de perturbación del gene se han utilizado para investigar el papel de los genes individuales en la patogenesia de la AML. Para lograr la interrupción del gen completo, muchos de estos estudios han hecho uso de modelos de complejos gene knockout. Si bien estos estudios con ratones knockout ofrecen un sistema elegante y comprobado para investigar relaciones genotipo a fenotipo, un método rápido y escalable para la evaluación de genes candidatos que juegan un papel en la proliferación de células AML o supervivencia en modelos AML le ayudará a acelerar el interrogatorio paralelo de múltiples genes candidatos. Los avances recientes en tecnologías de la edición del genoma han mejorado considerablemente nuestra capacidad para llevar a cabo las perturbaciones genéticas en una escala sin precedentes. Tal sistema de la edición del genoma es el método basado en el Cas9 CRISPR que puede utilizarse para hacer rápidas y eficaces alteraciones en el genoma de la célula blanco. La facilidad y la escalabilidad de la canceladura del gene CRISPR/Cas9-mediada, es una de las técnicas más atractivas para el interrogatorio de un gran número de genes en los ensayos fenotípicos. Aquí, presentamos un ensayo simple utilizando CRISPR/Cas9 mediada gen-interrupción combinada con ensayos de alto rendimiento basado en la citometría de flujo competencia para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel importante en la proliferación o la supervivencia del ser humano y líneas celulares de ratón AML.

Introducción

Las últimas décadas han visto numerosos esfuerzos de investigación se centró en la identificación de la contribución de principales vías moleculares en la patogenia de la leucemia mieloide aguda (AML). Tradicionalmente, interrupción de genes en las células de la AML se ha realizado con ratones knockout condicional o short hairpin RNA (shRNA). Mientras que los ratones knockout ofrecen un sofisticado sistema de control espacio-temporal de la canceladura del gene, generación de ratones knockout de genes es mano de obra intensiva, desperdiciador de tiempo y costoso. Por otra parte, gene knockouts utilizando estrategias de recombinación no es fácilmente escalable; Estas estrategias no se prestan bien al interrogatorio de varios genes en paralelo. Tras el descubrimiento de métodos de interferencia RNA mRNAs endógena de precipitación mediante ARN interferente pequeño (siRNA) o shRNA, muchos grupos comenzaron a utilizar técnicas de interferencia de RNA para investigar el papel de genes específicos en AML. Desde murinas y humanas células AML son notoriamente difíciles de transfectar utilizando métodos tradicionales de base de lípidos la transfección, la mayoría estudios shRNA empleada lentivirally o retrovirally codificadas para el estudio de funciones de los genes en las células de la AML. El reciente descubrimiento de agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y las nucleasas Cas asociadas (CRISPR-Cas9) ha revolucionado gene targeting tecnologías^1,2,3. Usando CRISPR Cas9, determinados genes o regiones genómicas pueden ser eliminadas, editadas o etiquetadas con eficacia y facilidad. Basado en el Cas9 CRISPR gene-edición surge ahora como el método de elección para investigar la relación genotipo-fenotipo en tipos de células diferentes debido a la simplicidad, eficacia y amplia aplicabilidad de esta técnica. También se están convirtiendo CRISPR Cas9-métodos basados en el método de elección en la AML, no sólo para interrogar a los genes individuales, sino también como una manera de objetivo de múltiples genes en pantallas genéticas vestidas o combinados destinado a investigar varios genes en paralelo como potencial AML-dependencias^4,5,6.

En este manuscrito, describimos un análisis simple crecimiento competitivo para la medición del impacto de la gene-interrupción en el crecimiento de las células de la AML, basado en estable mediada por Cas9 CRISPR gene-edición seguida por citometría de flujo de alto rendimiento. Este método es simple, eficiente y escalable a medio rendimiento experimentos para investigar el papel de varios genes en paralelo en las células de la AML.

Protocolo

1. generar AML celular línea Clones con alta expresión de Cas9 estables y activos

1. Producción de lentivirus Cas9
   1. Día 0: Placa 4 x 10⁶ 293T células en 10 mL de DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina y L-glutamina en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en una bioseguridad nivel 2 (BSL2) certifican campana de cultivo celular. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C.
   2. Día 1: Las células 293T plateado deben ser confluente de 70 – 80% el día 1. Realizar la transfección con el siguiente protocolo de la tarde.
   3. Calentar el medio de transfección, medios de cultivo y reactivo de transfección a temperatura ambiente. Descongelar todos la plásmidos necesaria para transfección.
   4. Mix 9 μg de psPAX2, 0,9 μg de pMD2.G y 9 μg de Cas9 pLenti plásmidos con 500 μl de medio de transfección en un tubo de 5 mL.
   5. Añadir 1,7 mL de medio de transfección a una 14 mL tubo de fondo redondo. Añadir 57 μl de reactivo de transfección directamente en el medio de transfección en el tubo para evitar el contacto con la pared del tubo.
   6. Suavemente, añadir la mezcla de plásmido toda solución de reactivo de transfección y mezclar golpeando suavemente el tubo en el lado. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min. Mientras tanto, cambiar el medio de la placa de semillas 293T.
   7. Añadir la mezcla de transfección gota a gota a la placa y con cuidado la placa hacia los lados para la mezcla eficaz. Colocar la placa en una incubadora de 37 ° C.
   8. Día 2: Aspirar el sobrenadante de la placa de la transfección con suavidad tal que las células no son perturbadas o desalojadas de la placa. Deseche el sobrenadante. Añadir 10 mL de medio DMEM de fresco 10% deslizando suavemente hacia abajo de los lados de la placa para evitar el desalojo de las células.
   9. Día 3: Recoger el virus con sobrenadante de la placa de transfección lentamente dibujando en una jeringa estéril de 10 cm. Después el sobrenadante se recoge en la jeringa, conecte un filtro μm 0.45 estéril en la jeringa y sostenga la jeringa y el filtro en un tubo cónico polipropileno de 15 mL estériles, fresco. Hundir suavemente la jeringa para filtrar los virus que contiene el sobrenadante a través del filtro de 0,45 μm en el tubo cónico de 15 mL polipropileno.
   10. Almacenar el medio condicionado viral en alícuotas de 2 mL en crioviales de 2 mL a-80 ° C.
2. Transducción de líneas de células de la AML
   1. Día -1: Diluir stock de fragmento de fibronectina humana recombinante de 1 mg/mL y 10 μg/mL con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Capa un cultivo de tejidos-no había tratado 6 bien la placa con 2 mL de la solución de trabajo de fragmento de fibronectina humana recombinante 10 μg/mL en una campana de cultivo celular BSL2 aprobado. Envolver la placa en el abrigo se aferra para evitar pérdidas por evaporación y almacenar a temperatura ambiente durante la noche.
   2. Día 0: Descongela el sobrenadante viral que contiene Cas9. Aspirar la solución de fragmento de fibronectina humana recombinante completamente de la placa de cubierta antes de spinfection. Añadir 2 mL de medio condicionado viral con Cas9 al plato y vuelta a 1.300 x g durante 90 minutos a 35 ° C. Esto ayuda a las partículas virales fije a la spinfected bien.
   3. Mientras tanto, contar las células para ser transduced y 2 x 10⁶ células en un tubo cónico de polipropileno de 15 mL. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 mL de medio de cultivo fresco.
   4. Después de spinfection, quite todo el sobrenadante viral de la spinfected bien y deseche. Las partículas retrovirales en el sobrenadante se unen a la parte inferior de la spinfected bien. A esto bien, añadir las 2 x 10⁶ células suspendidas en 2 mL de medio en el paso anterior.
   5. Haga girar la placa otra vez a 1.300 x g muy brevemente (1-2 min) suficiente para permitir que las células para instalarse en la parte inferior. Coloque la placa en la incubadora y dejar toda la noche para la transducción con las partículas virales spinfected conectadas al pozo.
   6. Día 1: Dependiendo de la densidad celular, añada medio más a las células transduced para evitar crecimiento excesivo.
   7. Día 2: Puesto que el plásmido pLenti Cas9 tiene un marcador de resistencia Blasticidin, agregue Blasticidin en una dosis de 10 μg/mL a untransduced y transduced (control) MOLM13 o células de la leucemia del ratón MLL-AF9 para la selección de Cas9 expresando las células.
      Nota: Blasticidin selección de las Cas9-transduced MOLM13 o MLL-AF9 células de leucemia se considera completa cuando se han eliminado todas las células del control untransduced. Para líneas celulares que no sean MOLM13 y MLL-AF9 leucemia, una curva de respuesta de dosis debe realizarse antes de este experimento por lo que puede emplearse una dosis óptima. Titulación del sobrenadante viral también se puede realizar en caso de tarifas bajas-transducción.
3. Selección de células expresando su alta Cas9 de clon.
   Nota: Hemos notado que en algunas líneas de células de la AML, selección de clones podría no ser necesaria: la mayor parte población Cas9-Blasticidin seleccionado ya tiene eficacia alta edición del genoma. En este caso, es posible omitir paso 1.3 y pasemos al paso 1.4 evaluar Cas9 expresión en las células AML a granel Cas9 blasticidin por borrar occidental. Todavía sería importante evaluar eficiencia edición de gene en esas células a granel Cas9 AML (paso 1.5) antes de proceder a los análisis de la competencia. Suponemos que la selección de clones de alta sola-Cas9 reduce la variabilidad edición del genoma, que es especialmente importante cuando se prueba un número de guía solo diferentes RNAs (sgRNAs).
   1. Realizar una sola célula de la Cas9 Blasticidin seleccionado MOLM13 y MLL-AF9 células de la leucemia, en adelante llamadas MOLM13-Cas9 y MLL-AF9-Cas9 células, respectivamente, mediante un clasificador de FACS contenido en una campana de BSL2 aprobado. Clasificación se puede realizar en 5 – 10 fondo redondo tejido de la cultura tratada 96 placas de pozos.
   2. Solo una vez MOLM13 Cas9 y MLL-AF9-Cas9 clones han sido recogidos y nombradas individualmente, amplían 10 – 20 clones con 10 μg/mL de Blasticidin en medios de cultivo para garantizar el mantenimiento de Cas9 expresión.
4. Expresión para comprobar de proteína estable de Cas9 immunoblotting.
   1. Hacer extractos nucleares de todos los clones de Blasticidin seleccionado de la leucemia MOLM13 y MLL-AF9 utilizando el Kit de extracción Nuclear según protocolo del fabricante. Compruebe el uso de Anti-Flag M2 anticuerpos desde el Cas9 en el plásmido pLenti Cas9 está vinculada a un epitopo de la bandera del N-terminal de la expresión de la proteína de Cas9.
   2. 50 μg de la proteína total de la carga de cada extracto nuclear en 10% Bis-Tris del gel y el gel en 120 V hasta bandas superiores están bien separadas.
   3. Bloquear la membrana con solución de leche de 5% en buffer TBST durante 1 hora.
   4. Incubar la membrana con 1:1,000 dilución del anticuerpo de Anti-Flag M2 a una concentración final de 1 μg/mL a 4 ° C durante la noche.
   5. Al día siguiente, lavar la membrana con buffer TBST e incubar con HRP conjugado anti-ratón de anticuerpo secundario a la dilución de 1:5,000 (concentración final de 0.16 μg/mL) a temperatura ambiente durante 1 h.
   6. Lavar la membrana con TBST y desarrollar la mancha blanca /negra usando sustrato de ECL.
   7. Toma 3-4 clones con la más alta expresión de la proteína de Cas9 por Western blotting para su posterior análisis funcional (figura 1).
5. Garantizar la alta actividad de Cas9 de clones seleccionados
   1. Preparar sobrenadante lentivirales de un vector de codificación de sgRNA con sgRNAs a los humanos o ratón AAVS1 locus de puerto seguro como se describe en el paso 1.1.
   2. Transduce la parte superior expresando Cas9 MOLM13 o leucemia MLL-AF9 clones con el anti-AAVS1 sgRNA lentivirales sobrenadante utilizando el método de spinfection descrito anteriormente. Seleccione con puromicina de 2,5 μg/mL durante 4 días.
   3. Purificar el ADN genómico de los clones de leucemia MOLM13-Cas9 o MLL-AF9-Cas9 después selección puromicina junto con los respectivos controles de tipo salvaje utilizando el kit de extracción de ADN genómico según las instrucciones del fabricante. Uso 50 ng de ADN como plantilla para realizar una PCR con la AAVS1_test_primers usando el 2 x master mix de Taq polimerasa y el programa PCR enumerados en la tabla 1.
   4. Ejecutar el producto PCR en un gel de agarosa al 2% y gel-purificar la banda de 268 pares utilizando un kit de extracción de gel según protocolo del fabricante. Secuencia de Sanger el gel purificado producto de la polimerización en cadena usando la cartilla de AAVS1_target-frag_F.
   5. Evaluar la eficacia de edición por la comparación de AAVS1 editado y secuencias de tipo salvaje utilizando herramientas basadas en web en línea (figura 2).

2. clonación y transducción de sgRNAs en las células de la AML Cas9

1. Rendimiento medio de la clonación de sgRNAs
   1. Diseño de 4 a 6 sgRNAs para el gen de interés mediante un software de diseño CRISPR basada en web. Hay una serie de herramientas de diseño CRISPR disponibles en línea como http://crispr.mit.edu/ que generan secuencias sgRNA basado en una secuencia de ADN de entrada.
      1. Rellene una información apropiada en los campos con asteriscos. Haga clic en el genoma de destino sgRNA diseño. Pegue la secuencia de destino en el cuadro de secuencia y haga clic en el botón Enviar .
   2. Para clonar en el pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido de expresión sgRNA W, anteponer los nucleótidos "CACC" oligo sentido y "AAAC" a la inversa oligo antisentido complementada antes de ordenar. Orden premezclado sentido y anti-sentido oligos en una placa de 96 pocillos etiquetados Oligo-Mix de una empresa de síntesis de oligonucleótidos.
      Nota: Hemos hecho uso de la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido W, que tiene el sitio de restricción BbsI sgRNA clonación. En el caso de otros plásmidos de expresión sgRNA se utilizan, los voladizos que se utiliza para los oligonucleótidos sgRNA deben cambiarse en consecuencia.
   3. Tomar una placa de 96 pocillos de fondo de U separada etiquetada Del recocido de la placa. Hacer una mezcla maestra de 1 μl de T4 PNK, 1 μl de 10 x buffer de ligadura de ADN T4 y 6 μl de agua por reacción de recocido.
   4. Añadir 8 μl de la master mix a cada pocillo de la placa de recocido. Añadir 1 μl de 100 μm, sentido y oligo antisentido (o 2 μl de oligos de sentido-anti-sentido mixto) a la mezcla principal. Pipetear 2 – 3 veces suavemente para mezclar bien, hacer girar la placa para obtener las mezclas hasta el fondo de los pozos.
   5. Usar el siguiente programa de recocido en una máquina PCR: 30 min a 37 ° C, 2 min 30 s a 95 ° C seguido de un enfriamiento lento a 22 ° C a una velocidad de 0.1 ° C/s. Después de recocer, tomar una placa de 96 pocillos fresca etiquetada OligoMix diluido. En esta placa, diluir los oligos fosforilada y recocido de la reacción anterior con agua (1: 200) utilizando una pipeta multicanal.
   6. Digest 5 μg de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vector W con 1,5 μl de enzima de la restricción del BbsI (10.000 unidades/mL) utilizando un buffer apropiado a 37 ° C por 2 h para linealizar para después de la ligadura.
   7. Un plato bien fresco 96 con Ligadura de la placa y añadir 20 ng de lo títulos BbsI digerido (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 vector de W a un pozo por ligadura sgRNA deseada. A esto, añadir 2 μl de oligos fosforilada, recocido de la placa de OligoMix diluido .
   8. Añadir 1 μl de tampón de ligasa de x T4 10 y 1 μl de la enzima T4 ADN ligasa. Pipetear con una pipeta multicanal e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h de ligadura.
      Nota: Mezclas de ligadura pueden almacenarse a-20 ° C para el paso de la transformación más adelante.
   9. Mientras tanto, deshielo 90 μl de químicamente competentes de e. coli las células en hielo 10 minutos antes del final de la etapa de la ligadura.
   10. Usando una pipeta multicanal, hacer 10 alícuotas de μl de células competentes en cada pocillo de una placa bien 96 independiente.
   11. Añadir la mezcla de la ligadura del paso 2.1.8 en el bien que contiene las células competentes, pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente e incubar 10 min a temperatura ambiente.
   12. Pipeta de 5 μl de la mezcla de ADN de bacterias directamente de la reacción anterior en 6 bien placa conteniendo agar LB con 100 μg/mL de ampicilina. Repetir para cada una de las reacciones de transformación.
   13. Cada reacción de la transformación en una por separado con bien de una placa de 6 pozos de la placa. Añadir aproximadamente 5-8 granos de cristal a cada bien y agitar la placa todo bien 6 8 a 10 veces en un movimiento circular.
   14. Recoger las colonias solo 1 – 2 cada pocillo con una pipeta de 20 μl estériles y raya en un lugar cuidadosamente etiquetado en un estéril 10 cm plato de Petri con agar LB y 100 mg/mL de ampicilina. Después de rayar en la placa LB, simplemente expulsar la punta utilizada para clon rayas en 3 mL de LB-ampicilina que contiene medio de 14 mL tubo de fondo redondo marcado con el correspondiente número de clon bacteriano.
   15. Enviar la placa bacteriana directamente para Sanger secuenciación con el primer avance humano U6 promotor.
   16. Después de la confirmación de la secuencia de sgRNAs clonado, purificar el ADN del tubo correspondiente de 14 mL con el equipo de mini-prep según las instrucciones del fabricante.
   17. Medir la concentración y la calidad de cada uno de lo mini-Prep con un espectrofotómetro. Normalizar cada mini-prep a una concentración de 15 ng/μl y pipeta en una placa bien 96 etiquetados sgRNA placa de Clones.
       Nota: Esta placa se puede almacenar a-20 ° C o utilizada directamente para la preparación de virus.
2. Producción viral de sgRNA construcciones y transducción de señales
   1. Para la producción de partículas lentivirales sgRNA en el formato de 96 pocillos, siga el "shRNAs/sgRNA/ORF alto rendimiento producción Viral (96 bien)" Protocolo de la plataforma genética de perturbación (web Portal GPP) del Instituto Broad (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
   2. Transfiera 200 μL de sobrenadante viral a tubos estériles y congelar inmediatamente a-80 ° C.
   3. Día -1: Aplique un fondo plano no tejido placa bien 96 de cultivo tratado con 100 μl del fragmento de la fibronectina humana recombinante a una concentración de 10 μg/mL en una campana de cultura BSL2 celular. Envolver la placa con cling wrap para evitar pérdidas por evaporación y dejarlo en el Banco durante la noche.
   4. Día 0: Quitar el fragmento de la fibronectina humana recombinante de cada pozo. Descongelar el sobrenadante viral de cada sgRNA a temperatura ambiente. Añadir 50 μl de sobrenadante viral de cada tubo a cada cubierta de la placa de la transducción de señales. Girar la placa de la transducción a 1.300 x g durante 90 minutos a 35 ° C.
   5. Hacia el final de spinfection, Conde MOLM13-Cas9 (clon B3) células del frasco de cultivo. Utilizan 10.000 células por pocillo en volumen μl 100. Contar las celdas de todos los pozos de la transducción de señales, habida cuenta de volumen muerto.
   6. Después de la spinfection de 90 min., retire el sobrenadante de todos los pozos utilizando una pipeta multicanal ajustada a 50 μl lentamente inclinando la placa. Añadir 100 μl del cultivo de las células del clon B3 MOLM13 Cas9 a cada bien poco a poco deslizarse desde el borde.
   7. Haga girar la placa a 1.300 x g durante 2 min a 35 ° C a dejar que las células a instalarse en la parte inferior. Transferir la placa a la incubadora de 37 ° C cultivo de tejido grado.
   8. Día 1: Agregue 100 μl de medio fresco a cada bien que contenga sgRNA transduced Cas9 MOLM13 o Cas9-MLL-AF9 leucemia células tal que el volumen final del medio es 200 μl.

3. ensayo de crecimiento competitivo

1. Día 3: 72 h (día 3) transducción de correos, compruebe el porcentaje de sgRNA que contiene las células positivas de BFP en cada pozo por citometría de flujo (FACS). Utilice un tinte de viabilidad celular para marcar y excluir las células muertas a partir del análisis.
2. Continuar volver a platear una proporción de las células en nuevos pozos con medio fresco después de cada análisis FACS para evitar crecimiento excesivo durante el ensayo.
3. Repita el análisis FACS cada 2 – 3 días para comprobar la proporción relativa de BFP positivos (BFP + ve) las células en comparación con el BFP negativo (BFP-ve) (figura 3). Analizar el porcentaje de células positivas de BFP para cada punto de tiempo (utilizando el FlowJo o software similar de análisis FACS).
   1. Arrastre archivos de Fcs para cada muestra a FlowJo software. Haga doble clic en cualquier archivo de una muestra y marca un punto borran de forward scatter (FSC) vs dispersión lateral (SSC) con FSC en el eje de X y SSC en eje Y. Todas las células de la puerta.
   2. Haga doble clic en las celdas cerradas y parcela a la tinción de viabilidad (en eje Y) versus altura FSC (H) o área (A) punto mancha blanca/negra. Las viabilidad Tinción negativa (en vivo) las células de la puerta.
   3. Haga doble clic en células vivas cerradas y parcela BFP (en eje Y) vs FSC (A) en el eje X. Ve células + puerta BFP. Estas puertas se aplican a todas las muestras arrastrando la muestra seleccionada a Todas las muestras en Grupo ficha.
   4. Haga clic en Editor de la tabla para hacer una tabla de análisis de las muestras. Arrastre BFP + ve cuenta de una muestra en la tabla y haga clic en el botón de pantalla en el Editor de la tabla para crear un informe de lote de todas las muestras con una tabla mostrando el porcentaje de células BFP + ve . Guarde la tabla como un xls.
4. Calcular el proporcional aumento o disminución en % células positivas de BFP en la población de células vivas en el tiempo y comparar esta relación a la proporción de células positivas de BFP en la sgRNAs de control (como luciferase, revueltos o GFP sgRNA).
5. Parcela la proporción de células positivas de BFP para el sgRNAs diferentes incluyendo los genes de interés, así como controles mediante día 3 como base.

Resultados

En nuestro estudio, nosotros primero transduced la MOLM13 humana AML línea celular que lleva a la translocación MLL-AF9 con virus de alto título codificación el plásmido lentivirales Cas9-blasticidin. En nuestras manos, a granel sin clasificar MOLM13 Cas9 células no muestran el alto nivel Cas9 expresión por borrar occidental y también no se realizó bien cuando ensayaron por edición-el método eficaz de genes descritos⁷. Por lo tanto, se procedió a establecer los clo...

Discusión

En este manuscrito, se describe un protocolo detallado para llevar a cabo un ensayo de crecimiento competitivo basado en el Cas9 CRISPR para investigar el papel de genes candidatos en líneas de células de la AML mediante citometría de flujo en células AML de humano/murino (figura 5). El objetivo del análisis es identificar el efecto de la canceladura del gene en el mantenimiento de la proliferación de células AML durante dos a tres semanas en una escala de rendimiento medio. Algunos pasos cr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FLAG-M2 Anticuerpo	sigma-aldrich	F3165, lote # SLBS3530V
Anticuerpo antiratón	Invitrogen	31446, lote # TA2514341
SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Sistema de imagen	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrífuga	Thermo Scientific
Blasticidina	Thermo Fisher	R21001
SYTOX	Rojo Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamina (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Suero fetal bovino (FBS)	SAFC	12303C
vector de ARNg único	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Kit de extracción nuclear	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectina	Takara	T100B
Citómetro	de flujo BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 tampón de ligadura de ADN	NEBioLabs	B0202S
T4 ADN ligasa enzima	NEBioLabs	M0202S
Ampicilina	Fisher scientific	BP1760-25
Agar LB	Fisher scientific	BP9724-500
LB Caldo	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-kit de preparación	Qiagen	27104
NanoDrop Espectrofotómetro	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
M-CSF murino recombinante	Peprotech	315-02
Células competentes	estables NEBiolabs	C3040I
10 cm Placas de cultivo de tejidos	Fisher Scientific	353003
Solución de lisis celular	Qiagen	158906
Solución de precipitación de proteínas	Qiagen	158910
Solución de hidratación de ADN	Qiagen	158914
QIAquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromicina	Fisher scientific	BP2956100
50 mL tubos cónicos de	polipropilenoFisher scientific	1495949A
15 mL tubos cónicos de polipropileno	Fisher scientific	1495970C