Artículo de método

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

DOI:

10.3791/58735

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7 de enero de 2019

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1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE) es importante en clínica y aplicaciones de la investigación. Un método óptimo de cuantificación es preciso, tiene un rango dinámico lineal amplio y mantiene la integridad estructural de la muestra para permitir la identificación de tipos de células individuales. Los métodos actuales como la inmunohistoquímica (IHQ), espectrometría de masas y immunoblotting cada uno no cumplan con estas disposiciones debido a su naturaleza categorial o necesitan homogeneizar la muestra. Como método alternativo, proponemos el uso de inmunofluorescencia (IF) y análisis de imagen para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí se demuestra que este método se optimiza fácilmente, produce un amplio rango dinámico y es linealmente cuantificable en comparación con el estándar de oro de immunoblotting cuantitativa. Además, este método permite el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra y permite la distinción de varios tipos de células, que puede ser crucial en aplicaciones de diagnóstico. En general, esto es un método robusto para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente para adaptarse a clínica o investigación necesidades.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existe la necesidad de cuantificar proteínas en muestras de biopsia de tejido de (FFPE) de formalina-fijos, parafina-encajado en muchos campos clínicos. Por ejemplo, cuantificación de proteínas biomarcadoras en especímenes de la biopsia de rutina se utiliza para aclarar el pronóstico y tratamiento para pacientes de cáncer1de informar. Sin embargo, los métodos actuales son generalmente subjetivos y carecen de validación.

Inmunohistoquímica (IHC) es utilizado rutinariamente en laboratorios de patología y generalmente depende de un anticuerpo primario contra la proteína diana y un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta enzimática como la peroxidasa de rábano picante2. IHC convencional es sensible, puede hacer uso de minutos de muestras y preserva la integridad morfológica de muestras de tejido, lo que permite la evaluación de la expresión de la proteína dentro de su contexto histológica relevante. Sin embargo, porque la señal cromogénica generada por IHC es sustractiva, se adolece de un relativamente estrecho rango dinámico y ofrece un potencial limitado de multiplexación2,3,4. Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MSI) la proyección de imagen preserva integridad morfológica. Sin embargo, este desarrollo de la tecnología está asociado con una modesta resolución morfológica y requiere calibración significativo y normalización, de afectar su viabilidad para el uso clínico rutinario5,6,7. Técnicas alternativas para cuantificar proteínas en muestras de tejido son immunoblotting8, espectrometría de masas en9,10,11y enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo12, cada de que comienza con un homogeneizado lisado del tejido de la muestra. Las muestras de tejido primario son heterogéneas que contienen una multitud de tipos celulares. Por lo tanto, técnicas que implican la homogeneización de las muestras no permiten la cuantificación de una proteína en una población celular particular de interés, como las células cancerosas.

Como IHC, si es aplicable a las pequeñas muestras de FFPE y permite la retención de la integridad histológica13. Sin embargo, gracias a la naturaleza aditiva de las señales de fluorescencia, si es favorable a la aplicación de múltiples anticuerpos primarios y etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, una proteína de interés se puede cuantificarse relativamente dentro de compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo y citoplasma) definidas por medio de otros anticuerpos o de células específicas. Señales de fluorescencia también tienen la ventaja de un mayor rango dinámico13,14. La superioridad, la reproducibilidad y la multiplexación potencial de si se aplica a muestras FFPE ha sido demostrada13,14,15.

Adjunto describimos el uso de immunoblotting cuantitativo utilizando las líneas celulares establecidas como patrón oro para determinar la naturaleza cuantitativa de si junto con análisis de imagen asistida por ordenador para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en secciones histológicas de muestras de tejido FFPE. Hemos aplicado este método con éxito en un enfoque múltiple para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia clínica16,17,18.

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Protocolo

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Aprobación de las muestras de tejido humano primario se obtuvo de las Ciencias de la salud y afiliados a hospitales de enseñanza investigación ética Junta (HSREB) en la Universidad de la reina.

1. construcción de una línea celular tejido microarrays (TMA)

  1. Cosecha y lavado de células.
    Nota: Este protocolo ha sido probado en varias líneas celulares inmortalizadas establecidas (por ejemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Para las células adherentes, cosecha aproximadamente 1.3 x 107 células una vez que alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Separar las células mediante un reactivo apropiado para esa línea celular.
      Nota: Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) se prefiere generalmente encima tripsina para reducir el riesgo de degradar proteínas de la superficie. Si usando tripsina, neutralizar la tripsina con suero bovino fetal (FBS) inmediatamente después de la cosecha de las células.
    2. Para las células de suspensión, de la cosecha aproximadamente 8 x 107 células en fase logarítmica de crecimiento.
    3. Recoger las células cosechadas/separado por centrifugación durante 5 min a 225 g de x en un tubo cónico de 50 mL.
    4. Decantar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 10 mL de 1 X de tampón fosfato salino (PBS). Centrifugar durante 5 min a 225 x g y decantar el sobrenadante.
      Nota: 1 X PBS está compuesto por NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 en agua destilada; ajustar el pH a 7,4.
  2. Fijar las células en formol y los pellets.
    1. Suspender el precipitado de células en el tubo cónico en 10 mL de formalina tamponada neutra 10% (NBF).
      Nota: NBF se puede preparar diluyendo 1 mL de solución stock de formaldehído al 37% en 9 mL de 1 X PBS.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar el formol y formaldehído. Utilice una campana de humos para pasos con formalina y formaldehído.
    2. Incubar las células en un eje de balancín a 24 rpm a temperatura ambiente durante la noche (aproximadamente 17 h).
    3. Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión en PBS 1% (0,01 g de agarosa por 1 mL PBS).
      1. Preparar suficiente para 500 μl de solución de agarosa por muestra de línea celular.
      2. Disolver la agarosa en un 80 ° C agua calor o baño de bloque, con la mezcla ocasional 2-5 minutos. Una vez disuelto, mantener la solución a 37 ° C calor o baño bloque de agua para prevenir el endurecimiento.
    4. Pellets de las células fijas de paso 1.2.2 por centrifugación durante 5 min a 225 x g. quitar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de PBS 1 x.
    5. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y de pellets por centrifugación durante 5 min a 290 x g. Aspire todo el sobrenadante.
  3. La fundición de las células en agarosa.
    1. Añadir ~ 500 μl de solución de agarosa al 1% (del paso 1.2.3) a cada tubo que contiene las células. Con suavidad, pero rápidamente, pipetee mezcla arriba y abajo utilizando una micropipeta P-1000 para mezclar.
      Nota: Corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar la abertura y evitar la formación de burbujas. Mantener la solución de agarosa de trabajo en el baño de agua de 37 ° C para prevenir el endurecimiento.
    2. Deje que la solución de agarosa-cell harden (5-10 min) a temperatura ambiente. Añadir 1 mL de 10% NBF a cada microcentrífuga del tubo que contiene una muestra y mantener a temperatura ambiente hasta parafina inclusión (hasta 24 h).
  4. El enchufe de agarosa se preparan para inclusión en parafina.
    1. Aspire de NBF de la muestra.
    2. Quite el tapón de la celda usando una cuchilla de afeitar para cortar el tubo de microcentrífuga, coloque el tapón de un cassette de plástico tejido. Almacenar cassettes en 10% NBF a temperatura ambiente.
  5. Procesar las muestras durante la noche ya sea manualmente o utilizando un procesador automatizado de tejido y embed en parafina utilizando métodos estándar de histología.
    Nota: Ver Fischer et al. 19 para un protocolo de ejemplo.
  6. Con un especializado instrumento de "arrayer tejido", cosecha duplicados núcleos de 0.6 mm de la parafina bloquean de cada línea celular e insertarlas, en filas, en un bloque de parafina recipiente vacío para crear una línea de celular TMA.
    Nota: Puede usarse métodos estándar tales como los descritos en Fedor y De Marzo a20.
  7. Incorporar núcleos de muestras primarias que representa 2-3 tipos de tejido adicional (por ejemplo, la amígdala, colon, los testículos, etc.) como controles positivos o negativos en el TMA. Elegir los tejidos que son apropiados para la proteína de interés.
  8. Utilizar un micrótomo para preparar cortes histológicos dos, aproximadamente de 4 a 6 μm de espesor, de la línea celular TMA. La sección de montaje en un portaobjetos de histología, secarlo y Desparafinizar (como se describe en Fedor y De Marzo a20).

2. muestra tinción por inmunofluorescencia

  1. Optimizar la dilución del anticuerpo primario.
    Nota: Existen protocolos estándar para la optimización de la IHC o si para las secciones de tejido FFPE como en Kajimura et al. 21. una breve descripción del enfoque se describe aquí.
    1. Preparar diluciones de 4 y 5 de primaria del anticuerpo a la proteína de interés guiados por las instrucciones del fabricante.
    2. Identificar un tipo de tejido de control de una fuente animal o humano que expresa la proteína de interés en poblaciones de células morfológicamente reconocible. Preparar las secciones del tejido y montaje en un portaobjetos procedimiento de inmunohistoquímica estándar como en Fedor y De Marzo a20.
      Nota: El número de secciones requeridas es el número de diluciones del anticuerpo primario más uno extra.
    3. Usar un sistema automatizado o manual por immunohistology, prueba las diluciones del anticuerpo primario 2.1.1 cada paso de una diapositiva en el paso 2.1.2. Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la diapositiva extra y utilizarlo como un control negativo.
    4. Durante el proceso de tinción, tinción todas las diapositivas con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y un anticuerpo secundario etiquetado fluorescente. Si se requiere de una mayor sensibilidad, utilizar un HRP (peroxidasa de rábano)-conjugado de anticuerpo secundario y sistema de amplificación de señal basado en tyramide (ver pila et al. 13).
      Nota: Cuando multiplexación anticuerpos primarios, se utiliza una etiqueta fluorescente diferente para cada proteína.
    5. Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.
    6. Utilizar software apropiado para ver las imágenes digitales y elegir empíricamente la dilución del anticuerpo primario que optimiza la intensidad de la señal con respecto a la fluorescencia del fondo.
      Nota: Si lo desea, esta optimización puede ocurrir usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) y microscopía brightfield.
  2. Realizar si la coloración en la línea celular TMA.
    1. Utilizar un sistema automatizado o manual por immunohistology manchar una diapositiva de la línea celular TMA con la dilución del anticuerpo primario optimizado (según lo determinado en el paso 2.1). Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la segunda diapositiva y usarlo como un control negativo.
    2. Durante el proceso de tinción, tinción con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y con un anticuerpo secundario y tyramide como en el paso 2.1.4 todas las diapositivas.
    3. Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.
    4. Utilice un paquete de software de análisis de imagen para identificar el compartimiento celular de interés (es decir, citoplasma y núcleo) y cuantificar la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada línea celular.
      Nota: Varios paquetes de software pueden ser utilizados para este propósito y muchos se discuten en pila et al. 13.

3. cuantitativa Immunoblotting de líneas celulares

  1. Preparación de lisados de las células.
    1. Cosecha de 2 millones de células de cada línea celular, como se describe en pasos de 1.1.1 a la 1.1.3.
    2. Girar las células por 5 min a 650 g de x en un tubo cónico de 50 mL. Decantar el sobrenadante.
    3. Lavar las células con 10 mL de PBS helado. Resuspender en 1 mL de PBS helado y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga según paso 3.1.2, decantar y dejar las células en hielo.
    4. Añadir 200 μL de tampón de lisis frío radioinmunoprecipitación (RIPA) con inhibidores de la proteasa (10 μl de los inhibidores de la X 100 por mL de tampón de lisis RIPA) a las células, vortex e incubar en hielo por 15 min.
      Nota: La cantidad de tampón de lisis para lisis eficaz varía por línea celular y puede determinarse empíricamente. Almacenador intermediario RIPA se compone de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, SDS 0.1% en agua destilada.
    5. Para asegurar carga relativamente incluso sobre los immunoblots, cuantificar las proteínas totales en una muestra de 20 μl de cada lisado usando un método apropiado como el ensayo de Bradford. Añadir aproximadamente 40 μl de tampón de lisis X Laemmli 6 para el resto (aproximadamente 180 μL) de cada lisado celular y hierve a 100 ° C en un baño de bloque o de calor durante 5 minutos.
      Nota: 6 X Laemmli buffer se compone de 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (p/v) de SDS, glicerol al 60%, 0.6% (w/v), azul de bromofenol 50 mM Ditiotreitol (DTT) en agua destilada.
    6. Almacenar las muestras a-20 ° C hasta por dos semanas.
  2. Realizar un immunoblot de todas las líneas de células para determinar qué línea celular tiene la proteína más abundante del interés.
    Nota: Siga el procedimiento descrito en Mahmood, T. y Yang, PC. 22, con las siguientes modificaciones.
    1. Alícuota de la célula lisado (preparado en paso 3.1) que contienen 10-50 μg de proteína (dependiendo de la abundancia de la proteína de interés) en tubos de microcentrífuga. Añadir 2,5 μl de Tampón Laemmli X 6 y de tampón de lisis RIPA suficiente para hacer el volumen hasta 15 μl.
    2. Carga un 5% de apilado y una concentración adecuada de resolver (por ejemplo, 10% para las proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE con una escalera de proteína y las muestras del paso 3.2.1. Carga 1 X Laemmli buffer en pocillos vacíos. Ejecute la fuente de alimentación en ajustes apropiados, por lo general 125 V, de 80 minutos o hasta que el tinte de azul de bromofenol alcanza la parte inferior de la placa.
    3. Realizar a una transferencia de proteína semiseco como se describe en Wiedemann et al. 23.
      Nota: para obtener resultados representativos, una membrana de nitrocelulosa (que no necesita ser empapado en metanol), y el tampón de transferencia de frío Bjerrum Nielsen Schafer (BSN) fueron utilizados. Buffer BSN está compuesta por 48 mM de Tris, glicina de 39 mM, 20% de metanol en agua destilada.
    4. Después de la transferencia, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontal para separar la parte que contiene la proteína de interés de una proteína de control interno apropiado, como GAPDH.
    5. Proceder al bloqueo y anticuerpo incubaciones con el amortiguador de bloqueo recomendado por el fabricante de los anticuerpos primarios.
      Nota: Las diluciones del anticuerpo primario óptimo pueden variar dramáticamente dependiendo de la sensibilidad y la abundancia de la proteína. Para abajo los resultados representativos, el anticuerpo a la proteína de interés requiere una dilución de 1:1,000 mientras que el control de la GAPDH requiere una dilución de 1:40,000. La dilución de anticuerpos secundarias utilizada fue 1:3, 000.
    6. Después de incubaciones de anticuerpo y el lavado de la membrana, coloque las tiras de membrana en una funda de plástico transparente como una bolsa de sándwich.
    7. Preparar enchanced de la quimioluminescencia (ECL) mezcla siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice una pipeta P-1000 para cubrir la membrana con la mezcla de ECL, cerca de la vaina e Incube las tiras de membrana con la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1-2 min.
    8. Coloque la envoltura de la membrana en una plataforma de proyección de imagen digital. Usar de la quimioluminescencia y detección colorimétrico marcador para capturar varias exposiciones de la membrana.
      Nota: Tiempos de exposición variará según la cantidad de proteína cargada, abundancia de la proteína diana, afinidad de anticuerpos etc. comienzan con una exposición automática (normalmente unos pocos segundos) y tiempos de exposición de prueba arriba y abajo en incrementos de unos pocos segundos.
    9. Empíricamente, o utilizando el software de análisis de imagen, determinar qué línea de célula expresa la proteína diana.
  3. Encontrar el rango dinámico lineal de cada anticuerpo primario usando una dilución seriada.
    1. Realizar pasos 3.2.1-3.2.8 utilizando una serie de diluciones seriadas de la línea celular que expresa la mayor concentración de la proteína diana (identificada en el paso 3.2.9).
    2. Utilizar software de análisis de imagen como el ImageJ para realizar densitometría ósea en las imágenes de la exposición.
      1. Por ejemplo, utilizar ImageJ, utilice la herramienta Selección Rectangular para seleccionar el primer carril del gel para cuantificar. Ir a analizar | Geles | Seleccione el primer carril. Usa el ratón para mover el rectángulo resultante sobre el carril siguiente. Ir a analizar | Geles | Seleccione siguiente carril. Varias veces mover el rectángulo en el carril siguiente y seleccione el carril para el resto de los carriles.
      2. Ir a analizar | Geles | Trama de carriles. Utilice la herramienta de Línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico para eliminar ruido de fondo. Utilice la herramienta varita para seleccionar cada pico y recoge la densidad de cada pico, en adelante denominado intensidad de banda, desde la ventana de resultados .
    3. Uso de la densitometría de salida para crear un diagrama de dispersión de la banda intensidad versus la cantidad de proteína total cargado para cada anticuerpo primario. Usando una línea de mejor ajuste y una inspección visual, determinar la ubicación (rango de intensidad) de la gama dinámica lineal de cada anticuerpo.
    4. Elegir una concentración de la proteína que genera un valor en el extremo superior de la gama linear a la concentración hacia adelante con todas las líneas de la célula.
      Nota: Dado que esta concentración está por debajo del nivel de saturación en la línea celular con la mayor cantidad de esta proteína, no debe existir ningún peligro de sobre exponer las bandas para las otras líneas celulares.
  4. Realizar un immunoblot usando la concentración de proteína en paso 3.3.4 para todas las líneas celulares y repita los pasos 3.2.1-3.2.8.
    1. Realizar densitometría ósea en los escaneos digitales como en el paso 3.3.2. Elegir las imágenes de las exposiciones que producen señales dentro de las gamas lineares para cada anticuerpo identificado en el paso 3.3.3.
    2. Usando las señales de intensidad de la banda de la exposición ideal de 3.4.1, calcular el ratio de intensidad de banda de proteína de la blanco carga intensidad de la banda de control para cada línea celular. Estos valores de relación indican la abundancia relativa de la proteína diana de interés.
    3. Realizar una prueba de correlación de Pearson (se puede hacer utilizando un paquete de software estadístico) para correlacionar los valores obtenidos del análisis de la imagen del IF tinción (paso 2.2) a los obtenidos de immunoblotting (paso 3.4.2).

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Resultados

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Este protocolo se utiliza para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 en líneas celulares hechos en bloques de tejido FFPE. Bcl-2 cuantificación selectivamente en las células cancerosas puede dilucidar mecanismos oncogénicos y puede ser útil en el diagnóstico patológico y en informar de las decisiones de manejo clínico24. Más específicamente, Bcl-2 desempeña un papel en el correcto desarrollo del linfo...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos descrito un método que hace uso de immunoblotting cuantitativa (IB) para demostrar la utilidad de la inmunofluorescencia (IF) para determinar la abundancia relativa de una proteína diana en muestras de tejido FFPE. Métodos de cuantificación de proteínas actuales están limitados por su naturaleza categorial, como cromógeno IHC2,3, o por la necesidad de homogeneizar las muestras, prevención de la investigación sobre las poblaciones de la célula y estructura d...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fredrick Banting y Charles Best Canadá postgrado becas (A.M.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
697DSMZACC 42Línea celular
JeKo-1ATCCCRL-3006Línea celular
JurkatATCCTIB-152Línea celular
RCH-ACVDSMZACC 548Línea celular
Granta-519DSMZACC 342Línea celular
REHDSMZACC 22Línea celular
RajiATCCCCL-86Línea celular
HeLaATCCCCL-2Línea celular
Solución de tripsina/EDTAInvitrogen R001100Para el desprendimiento de células adhesivas
Suero fetal bovino (FBS)Wisent Inc.81150Para neutralizar la tripsina
Protocolo de formalina tamponada neutra245-684Para la fijación de gránulos
celulares UltraPure agarosa de bajo punto de fusiónInvitrogen15517-022Para la fundición de gránulos
de células Anticuerpo monoclonal anti-humano Bcl-2 de ratón, clon 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Para detectar Bcl-2 por inmunofluorescencia e inmunoblot (lot#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Parala automatización de la tinción por inmunofluorescencia
Sistema EnVision+- Polímero marcado con HRP (anti-ratón)Dako (Agilent)K4000Para la amplificación de señales de inmunofluorescencia
Sistema EnVision+- Polímero marcado con HRP (anti-conejo)Dako (Agilent)K4002Para la amplificación de señales de inmunofluorescencia
Cianina 5 reactivo de tiramidaPerkin ElmerNEL745001KTPara la amplificación de señales de inmunofluorescencia
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Paraver portaobjetos escaneados
Software de análisis de imágenes HALOIndica Labs-Parala cuantificación de inmunofluorescencia
Inhibidores de la proteasa (cóctel de inhibidores de la proteasa Halt, 100X)Thermo Scientific1862209Para añadir a Tampón RIPA
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)BioShopEDT001Para tampón RIPA
NP-40BDH Limited56009Para tampón RIPA
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750Para tampón RIPA
GlicerolFisherBiotechBP229Para tampón Laemlli
Azul de bromofenolBioShopBRO777Para tampón Laemlli
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Para tampón Laemlli
Albúmina sérica bovina (BSA)BioShopALB001Para lavados con inmunotransferencia
Escalera de proteínas (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Para ejecutar gel de proteínas
Papel de filtro (Papel de secado extra grueso)Bio-Rad1703969Para secar de transferencia
Membrana de nitrocelulosaBio-Rad162-0115Para transferencia
de transferencia Trans-blot SD célula de transferencia semisecaBio-Rad1703940Para transferencia semiseca
Leche desnatada en polvo (Leche en polvo descremada)Tecnología de señalización celular9999SPara tampón de bloqueo
Tween 20BioShopTWN510Para tampón de lavado
GAPDH conejo anticuerpo monoclonalEpitomics2251-1Anticuerpo primario de la proteína de control (lote#: YE101901C)
Anticuerpo anti-ratón de cabra IgG (conjugado con HRP)abcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Anticuerpo secundario para inmunoblot
Anticuerpo de cabra anti-conejo IgG (HRP conjugado)abcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Anticuerpo secundario para inmunoblot (lote#: GR3192725-5)
Clarity Western Sustratos ECLBio-Rad1705060Para la detección de señales de inmunotransferencia
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Para la detección de señales de inmunotransferencia
Software ImageJFreeware, NIH-Paraanálisis de densitometría

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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