Niveles de giberelina celular visualizado utilizando la energía de resonancia NlsGPS1 Förster transferencia Biosensor (traste)

Resumen

Giberelina percepción Sensor 1 (GPS1) es el primer Förster Resonancia energía basada en la transferencia biosensor para la medición de los niveles celulares de fitohormonas giberelina con una alta resolución espaciotemporal. Este protocolo informa sobre el método para visualizar y cuantificar niveles de giberelinas celular usando el biosensor nlsGPS1 genéticamente codificados en hipocotilos de Arabidopsis y ápices.

Resumen

La giberelina fitohormona (GA) es una molécula de señalización pequeño, móvil que juega un papel clave en la germinación de la semilla, elongación celular y las transiciones del desarrollo en plantas. Giberelina percepción Sensor 1 (GPS1) es la primera transferencia de energía de resonancia de Förster (traste)-basado biosensor que permite la monitorización de niveles de GA celulares in vivo. Mediante la medición de una tasa de emisión de fluorescencia de nuclear localizada-GPS1 (nlsGPS1), es factible a escala celular cartografía espacio-temporal de endógeno y exógeno suministrados gradientes de GA en tipos de tejido diferentes. Este protocolo describe la imagen nlsGPS1 coeficientes de emisión en tres experimentos ejemplo: estado de equilibrio, antes y después giberelinas exógenas A₄ (GA₄) tratamientos y sobre un curso de tiempo de tratamiento. También ofrecemos métodos para analizar ratios de emisión de nlsGPS1 con Fiji y un software de visualización y análisis comercial micrografía (3D) tridimensional y explicar las limitaciones y trampas probables de usar nlsGPS1 para cuantificar niveles de giberelinas.

Introducción

Las hormonas vegetales juegan un papel fundamental en el desarrollo y crecimiento de las plantas. Estas moléculas de señalización pequeño, móvil son reguladas normalmente en varios niveles, tales como biosíntesis, catabolismo y transporte de corta y larga distancia^1,2,3,4. La comprensión de las vías de señalización hormonal y posteriores respuestas transcripcionales ha agudizado con los años. Sin embargo, para vincular las diversas respuestas celulares de las vías de señalización de la hormona con las entradas reglamentarias dirigir distribuciones de hormona, se requiere una cuantificación espacio-temporal de los niveles hormonales a escala celular. Biosensores basados en el traste que pueden detectar fitohormonas pueden promover la capacidad de los científicos a cuantificar los niveles de la hormona a escala celular. Biosensores basados en traste consisten en un par de trastes (donador y aceptor proteínas fluorescentes) ligado a un dominio sensorial que se une un ligando específico o responde a un estímulo biológico. Para biosensores de molécula pequeña, ligando provoca un cambio conformacional del dominio sensorial que resulta en un cambio de distancia y orientación entre las dos proteínas fluorescentes de la pareja de traste. Un análisis radiométrica de un biosensor de traste se logra excitar al donante y medir la proporción de emisión de fluorescencia de aceptador en donantes^5,6. Atascamiento del ligand es detectable como un cambio en esta relación emisión del⁷.

Recientemente se desarrolló un biosensor basado en el traste para la hormona de la planta GAs de Georgia son una clase de hormonas que puede promover la germinación de las semillas, elongación celular y la transición del desarrollo de vegetativo a las fases de floración. El biosensor nlsGPS1 es nuclear localizada y ofrece ideas spatiotemporal sobre dinámica de GA en los tejidos vegetales diversos. En Arabidopsis las células, GA se une a receptores solubles, insensibles a la giberelina enano (GID), y el complejo induce la degradación de proteínas DELLA que actúan como reguladores negativos de GA²de señalización. El dominio sensorial GA de nlsGPS1 consiste en el receptor de Arabidopsis GA (AtGID1C) vinculado a un truncamiento ácido 74 aminoácidos de una proteína de DELLA (AtGAI) y un par de trastes de mejoradas variantes de dimerización de Cerulean como la proteína fluorescente de donantes y Afrodita (una codón-diversified Venus) como el aceptador de la proteína fluorescente⁸. El biosensor de nlsGPS1 es un sensor de alta afinidad para el bioactivo GA₄ (K_d = 24 nM para GA₄) y puede ser utilizado en diversos tipos de tejido y cuantificar gradientes de GA. Para evitar la interpretación de los niveles de Arabidopsis GA en vivo, también hemos desarrollado una variante no responde de la nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) para usar como control negativo. La proteína NR nlsGPS1 lleva en el bolsillo de unión a GA las mutaciones que alteran la Unión de la GA y mutaciones en la proteína DELLA que interrumpen la interacción con el GID del receptor proteínas^7,9. Patrones de relación de emisión o cambios observados en las líneas nlsGPS1 y nlsGPS1-NR pueden considerarse artefactos no directamente relacionadas con eventos de unión a GA. También es importante tener en cuenta que nlsGPS1 de unión a GA₄ no es rápidamente reversible, y por lo tanto, ratios de emisión celular nlsGPS1 deben interpretarse como que representa la mayor concentración reciente de GA en un núcleo determinado, más que el tiempo real niveles de estado estacionario. Como consecuencia, un análisis de la caída de los niveles de GA no es posible con nlsGPS1.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la utilización de un biosensor de nlsGPS1 en las células de la planta modelo Arabidopsis, mediante enfoques basados en la proyección de imagen confocales en una alta resolución. El protocolo proporciona información sobre proyección de imagen de las raíces de plantas y hypocotyls en estado estacionario y sobre cursos de tiempo. El sensor de nlsGPS1 potencialmente podría utilizarse en diversos tipos de tejidos, así como a través de especies de plantas, mapear y cuantificar las distribuciones GA.

Protocolo

1. preparaciones

1. Preparar ½ Murashige y Skoog agar pH 5.7 no sacarosa (1 L).
   1. Disolver 2,2 g de medio basal Murashige y Skoog (MS) en 950 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 5.7 con 5 M de KOH.
   2. Conforman la solución hasta un volumen final de 1 L con agua ultrapura. Dividirla en dos botellas de 500 mL, cada que contiene agar 1% planta. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
2. Preparar el líquido MS ¼ a pH 5.7 no sacarosa (1 L).
   1. Disolver 1,1 g de MS en 950 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 5.7 con 5 M de KOH. Conforman la solución hasta un volumen final de 1 L con agua ultrapura. Dividirla en dos botellas de 500 mL. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
3. Preparar GA₄.
   1. Disolver el GA₄ en etanol 70% para una concentración final de stock de₄ 100 mM GA.
   2. Para preparar la solución de trabajo, diluir el stock de₄ GA a 0.1-1 μm en el MS ¼ líquido pH 5.7.

2. crecimiento de la planta

1. Esterilizar las semillas de Arabidopsis .
   1. Trabajar con una campana química. Alícuota de las semillas (aproximadamente 200 semillas) en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Use un marcador con tinta resistente al cloro y colocar los tubos con las tapas abiertas dentro de la nave de esterilización (una caja grande que puede sellarse).
   2. Coloque un vaso de precipitados de 250 mL que contenga 50 mL de agua ultrapura y 50 mL de solución de hipoclorito de sodio dentro de la nave de esterilización.
   3. Añadir 3 mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl) en el vaso. Inmediatamente sellar el recipiente y permite la esterilización por gas de la clorina para 6-16 h.
   4. Después de unsealing el vaso, cerrar las tapas de todos los tubos de microcentrífuga en la canasta de semillas. Semillas esterilizadas pueden conservarse secos hasta el momento de la galjanoplastia.
2. Sembrar aproximadamente esterilizada 20 semillas de Arabidopsis en MS ½ placas cuadradas de agar. Sellar las placas con esparadrapo poroso y envolverlos con papel de aluminio. Incubar a 4 ° C durante 1 – 3 días para la estratificación.
3. Para proyección de imagen de la raíz, la transferencia de las placas a la cámara en posición vertical durante 3 días con las siguientes condiciones de crecimiento: condiciones de día largo (LD, 16 h de luz/8 h oscuridad); µmol⋅m 120^-2s^-1 intensidad de la luz; temperatura de 22 ° C (durante el ciclo de luz) o 18 ° C (durante el ciclo oscuro), 65% humedad relativa (HR).
4. Para hipocótilo cultivados en oscuridad: transferir las placas de la cámara de crecimiento para un pulso de luz de 1-4 h para sincronizar la germinación. Envuelva las placas con papel de aluminio y coloque la cámara en posición vertical durante 3 días.

3. preparación de la muestra

1. Mediciones de estado estacionario (figura 1A)
   1. En un portaobjetos limpio, añadir 50 μl de líquido MS ¼ (en adelante denominado como falsa solución). Suavemente la transferencia de plántulas expresando nlsGPS1 de la placa a la diapositiva.
   2. Tomar un cubreobjetos limpio y observar una gota de grasa para vacío en cada esquina del cubreobjetos. Coloque suavemente el cubreobjetos sobre las plantas de semillero y cuidadosamente añada extra falsa solución para eliminar las posibles burbujas de aire.
2. Tratamiento de GA₄ : experimento del intercambio químico (figura 1B).
   1. Antes del tratamiento de₄ GA, use una jeringa de 20 mL llenada de grasa para vacío (unido a una punta de la pipeta) para dibujar un rectángulo (longitud: 3,5 cm, altura: 2,5 cm) con una capa uniforme de grasa para vacío en un portaobjetos limpio de vidrio (figura 1B). Para lograr una línea fina de grasa para vacío, debe cortarse la punta de la pipeta para tener una abertura de 1 mm de diámetro.
   2. Añadir 50 μl de solución falsa a la diapositiva de cristal. Con unas pinzas limpias, escoger las plantas de semillero de nlsGPS1 y suavemente en la solución falsa. Para evitar cualquier daño, transferencia de las plantas de semillero apoyando la parte inferior de los cotiledones sin sujetando la plántula con el fórceps.
   3. Tomar un cubreobjetos limpio y observar una gota de grasa para vacío en cada esquina del cubreobjetos. Usando las pinzas, coloque el cubreobjetos en el centro del rectángulo vacío grasa. Ahora el cubreobjetos está sellado en los dos lados correspondientes a los bordes largos del rectángulo vacío grasa.
   4. Cuidadosamente añadir extra falsa solución para llenar el recipiente y eliminar burbujas de aire en el depósito sin molestar a los seedling(s) dentro.
   5. Adquirir las imágenes antes del tratamiento de₄ GA utilizando un microscopio confocal. Siga las instrucciones tal como se describe en la sección 4 del presente Protocolo.
   6. Para el tratamiento de₄ GA, sacar el portaobjetos de la etapa confocal. Ajustar un temporizador de 20 minutos.
   7. Después de iniciar el temporizador, intercambio de la solución tampón con MS ¼ líquido que contiene 1 μm GA₄. Añadir la solución de₄ GA (aproximadamente 50 μL) del lado izquierdo del cubreobjetos y quitar la anterior solución (falsa) del lado derecho. Mantener en el intercambio de la solución para reemplazar la solución falsa totalmente, que tarda aproximadamente 10 minutos (figura 1B).
   8. Coloque el portaobjetos de cristal en la platina del microscopio. Esperar otros 10 minutos antes de adquirir la imagen después de GA.
3. Puesta en marcha de un curso de tiempo para el tejido de interés
   Nota: El tejido de interés podría ser, por ejemplo, hipocotilos o raíces. Rutinariamente realizamos cursos de tiempo para nlsGPS1 biosensor utilizando un sistema de perfusión comercial la proyección de imagen (figura 1, véase Tabla de materiales) o una RootChip^7,10,11.
   1. Añadir 200 μL de solución falsa al centro del canal de la perfusión de la pegajosa-diapositiva (véase Tabla de materiales). Suavemente seleccionar plántulas de nlsGPS1 y en la solución falsa en la pegajosa-diapositiva.
   2. Con unas pinzas, suavemente ponga el cubreobjetos de vidrio y, usando la parte trasera de las pinzas, presione suavemente en los bordes del cubreobjetos para que forme un fuerte lazo con el material pegajoso en la periferia de la pegajosa-diapositiva.
   3. Usando dos codo Luer conectores (con un diámetro interno [ID] de 0,8 mm) y el tubo de silicona (con un ID de 0,8 mm), conecte la pegajosa-diapositiva a una jeringa de 20 mL y un envase de salida que recoge la solución de salida. Utilice el conector de cierre Luer (con un ID de 0.8 mm) para conectar la jeringa a la tubería del silicón.
   4. Presione suavemente la jeringa que contiene la solución falsa manualmente para dejar suficiente solución pasar por la cámara por lo que no hay burbujas de aire en la cámara. Coloque y sostenga la jeringa en la bomba de jeringa programable.
   5. Configure los parámetros de la bomba concreta a la jeringa usada (es decir., diámetro y volumen) junto con la velocidad de flujo según el manual suministrado con la bomba.
      Nota: En este protocolo, se utilizó una tasa de flujo de 1 – 3 mL/h, y esto puede cambiar según las exigencias experimentales. A partir de la bomba para iniciar el curso del tiempo.
   6. Para el tratamiento de₄ GA durante un transcurso de tiempo (figura 1), detener la perfusión por una pausa de la bomba y cambiar la jeringa con un nuevo uno que contiene ¼ MS líquido suplementado con GA₄. Proceder con la proyección de imagen confocal como se muestra en la siguiente sección.

4. microscopía

Nota: Realizamos microscopía láser confocal.

1. Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal equipado con rayos láser para realizar proyección de imagen de traste.
   Nota: Para nlsGPS1, son imágenes de variantes de la proteína fluorescente ciánica (PPC) y proteína fluorescente amarilla (YFP). En este protocolo, se utilizan microscopios comerciales (véase Tabla de materiales, como el microscopio 1 y 2) con 10 x o 20 x seco 0,70 armónico compuesto PLAN APO objetivos.
2. Para microscopio 1, uso 448 nm y 514 láseres nm de longitud de onda para excitar el PPC y YFP, respectivamente. Adquirir las exploraciones secuenciales. Coloque detectores (por ejemplo, HyD SMD) para detectar 460-500 nm para PPC (emisión del donante) y 525 – 560 nm para YFP (emisión de traste) después de la excitación de PPC. Con una segunda secuencia, defina un detector para detectar 525 – 560 nm para YFP (emisión de YFP) después de la excitación de YFP.
   Nota: Esta fluorescencia YFP se utiliza como un control de la expresión, así como en la segmentación de los núcleos, para generar las superficies usando una micrografía 3D comercial visualización y software de análisis.
3. Para microscopio 2, uso 440 nm y 514 nm longitud de onda láser las líneas para excitar PPC y YFP, respectivamente. Adquirir dos pistas. Para la pista 1, fijado (por ejemplo,., ChS) detectores para detectar 464 – 500 nm para PPC (emisión del donante) y 526 – 562 nm para YFP (emisión de traste) después de la excitación de PPC. Para la pista 2, establecer un detector para detectar 526 – 562 nm de YFP (emisión de YFP) después de la excitación de YFP.
   Nota: Esta fluorescencia YFP se utiliza como un control de la expresión, así como en la segmentación de los núcleos, para generar las superficies en el software de análisis y visualización 3D.
4. Adquisición de imágenes mediante un formato de 512 x 512 píxeles y una resolución de 12 bits.
5. La ganancia debe ser ajustada a un valor determinado empíricamente que permite una buena señal y no saturando píxeles. La ganancia no se debe cambiar entre PPC y traste la emisión sobre el experimento. Coloque el alfiler 1 unidad aireada (AU). Coloque el IBIDI pegajoso-portaobjetos en la etapa del microscopio confocal y proceder con la proyección de imagen como se muestra.
6. En el software del microscopio 1, mientras que en un escaneado activo, utilizar el resplandor más/menos situado en la parte superior izquierda de la pantalla de imagen para determinar la subexposición y la saturación de la región de interés. En el software del microscopio 2, utilizar el Indicador de rango situado en la parte inferior de la pantalla de imagen para determinar la subexposición y la saturación de la región de interés. Para cualquier análisis de imagen cuantitativo, no debería haber ninguna saturación de píxeles.
7. Coloque las pilas en forma de z con un tamaño de paso de 1 μm. El tamaño de paso puede ser reducido para una mayor resolución de z o aumentado para un aumento de la velocidad de adquisición o a aumentar el número de posiciones y muestras que puede ser reflejada. Para el curso de tiempo automatizados, ajuste la hora junto con el z-pilas (modo xyzt de la ficha de modo de adquisición) para adquirir las imágenes en intervalos de tiempo.

5. imagen análisis con Fiji

Nota: Con ImageJ (Fiji) es posible procesar datos de imágenes y producir imágenes bidimensionales (2D) de la relación de emisión nlsGPS1 en plántulas de Arabidopsis . Ejemplos de imágenes, ver figura 2A, 2C, 2E, 2 Gy 3A. En ImageJ, es posible encontrar cada comando del presente Protocolo mediante la función de búsqueda. Presione la barra espaciadora y L en el teclado del ordenador. Se abrirá una nueva ventana; Escriba el comando requerido en el campo de búsqueda.

1. Arrastre el archivo (archivos de LIF o .lsm) Fiji (imagen J) y abra las imágenes como hyper-pila.
2. En el menú principal, seleccione imagen > Stack > proyecto Z y seleccionar segmentos suma para capturar todos los píxeles en lugar de sólo los píxeles más brillantes como en proyección máxima.
3. En el menú principal, seleccione proceso > restar fondo y conjunto el balanceo radio de bola a 50 píxeles. Deseleccionar todas las opciones y las tres imágenes del proceso. Este paso elimina el fondo utilizando el algoritmo de "bola de balanceo".
   Nota: 50 píxeles se determinó empíricamente que incluyen núcleos como primer plano.
4. En el menú principal, seleccione imagen > Color > dividir canales. Abrirán tres nuevas ventanas: C1-suma (canal de PPC); C2-suma (Canal de traste) y C3-suma (canal de YFP).
5. Seleccione la ventana C3-suma y, en el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1 para reducir el ruido de la imagen.
6. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contraste y auto select.
7. En el menú principal, seleccione proceso > mejorar el Contrastey conjunto saturado = 0.35.
8. En el menú principal, seleccione imagen > tipo > 8 bits y las pilas a convertir una imagen de 8 bits.
9. En el menú principal, seleccione imagen > ajustar > Umbral de Auto-Local. En el Umbral de Auto-Local, seleccione los siguientes parámetros: método de Phansalkar, radio = 15, parámetro 1 = 0, parámetro 2 = 0y pila blanca. En este paso, pilas de YFP se utilizan para hacer una máscara binaria.
10. Seleccione la ventana Suma C2 y, en el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1.
11. Seleccione la ventana de la Suma de C1 y, desde el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1.
12. Para crear la pila de la relación de emisión de los dos canales desde el menú principal, seleccione proceso > Calculadora de la imagen. En la nueva ventana que aparecerá, seleccione Suma C2 como imagen 1, seleccione dividir como operador y seleccione C1 suma como imagen 2.
13. Asegúrese de que seleccionar crear una nueva ventana y el formato de 32 bits. Aparecerá una nueva ventana nombre Resultado de la suma C2.
14. En el menú principal, seleccione imagen > tabla de búsqueda > LUT 16_colors.
15. En el menú principal, seleccione proceso > Calculadora de la imagen. En la nueva ventana que aparecerá, seleccione Resultado de la suma C2 como imagen 1, seleccione multiplicar como operador y seleccione C3-suma como imagen 2. En este paso, la máscara binaria de YFP se multiplica con la pila de YFP/CFP para mostrar sólo los píxeles en el canal de control YFP.
16. En el menú principal, seleccione proceso > matemáticas > dividir y set el valor 255. En la nueva ventana que se abre, seleccione sí para analizar todas las imágenes de la pila. Una nueva imagen aparecerá nombre Resultado de resultado de C2 suma.
17. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contraste y seleccione Auto.
18. En el menú principal, seleccione proceso > Mejorar el contrastey, a continuación, seleccione tipo saturado = 0.35.
19. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contrastey valores mínimos y máximos para capturar la distribución de GA. Paso opcional: desde el menú principal, seleccione análisis > herramientas > Calibración Bar y bar Show LUT-calibracióny guardar el Resultado de resultado de C2 suma como un archivo TIFF.
20. Para obtener valores de la emisión de razones, desde el menú principal, seleccione analizar > configurar medición y seleccione gris valor medio y desviación estándar.
21. Seleccione la forma de rectángulo de la barra de herramientas y dibuje un área de interés (ROI). En el menú principal, seleccione analizar > medida. Una nueva ventana informará el valor medio de la ROI seleccionada.
22. Copiar y pegar los valores obtenidos en el software de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel o OriginPro) y hacer un histograma para un tratamiento antes y después GA₄ experimentar o un gráfico de línea para un curso de tiempo experimentar.

6. imagen análisis utilizando Software de análisis y visualización 3D

Nota: La ventaja de usar el software seleccionado (véase Tabla de materiales) es segmentar objetos (por ejemplo, núcleos) y crear imágenes 3D de una z-pila confocal. Ejemplos de imágenes, ver figura 2B, 2D, 2F, 2 Hy 3B.

1. Abra el software e importar el archivo (archivos de LIF o .lsm).
2. Segmento basados en el canal de emisión de YFP de control mediante el Asistente para las superficiesde los núcleos. Los objetos segmentados se llaman "superficies". Este paso de segmentación permite el análisis de todos los vóxeles en un núcleo como un objeto, eliminar fondo de vóxeles fuera del núcleo.
3. En el Asistente de superficies, establecer la sustracción de fondo (contraste local) a 3 μm y el umbral por defecto. Máscara de la CFP emisión (emisión de donantes de excitación de donantes [DxDm]) y canales de emisión (emisión de aceptador de excitación de donantes [DxAm]) traste partiendo de las superficies creadas mediante el canal YFP emisión (emisión de aceptador de excitación de aceptador [AxAm]).
4. Utilizar la extensión XT significa intensidad relación para calcular un cociente de la emisión de aceptador de excitación donantes dividido por la emisión del donador donante excitación (DxAm/DxDm) entre los valores de la intensidad media de las superficies individuales en los dos canales.
   Nota: Esta extensión está disponible para su descarga.
5. Para las superficies individuales con el cociente de la emisión de nlsGPS1 de color, seleccione Color de codificación con las estadísticas, que se representa como un icono de la rueda de color. Seleccione significa cociente de intensidad como tipo de estadísticas.
6. Exportación de los cocientes de los valores individuales de la tabla, que se encuentra bajo el icono de estadísticas .
7. Copie y pegue los valores en una hoja de cálculo y hacer un histograma para antes y después el GA₄ tratamiento experimentos o un gráfico lineal de tiempo curso de experimentos.

7. estadístico análisis

Nota: Ver figura 3D para una parcela beeswarm y cuadro de coeficientes de emisión nlsGPS1.

1. Abra el software y pegue el cociente de la emisión de las superficies de los núcleos Y columnas.
2. Seleccione las columnas de interés y estadísticas > Estadísticas Descripción > prueba de normalidad para saber si las muestras se distribuyen normalmente. Ejecutar la prueba de normalidad y una nueva ventana se abrirá y reportar los resultados.
3. Si las muestras se distribuyen normalmente, uso el t-test como prueba estadística. Seleccione estadísticas > comprobación de hipótesis > prueba de t de dos muestras en filas y correr el t-test.
4. Si las muestras no se distribuyen normalmente, seleccione estadísticas > comprobación de hipótesis estadísticas > dos muestras prueba de varianza para conocer si la variación entre las muestras no es significativamente diferente.
5. Si la varianza no es significativamente diferente, use la prueba U de Mann-Whitney como prueba estadística. Seleccionar estadística > Pruebas no paramétricas > prueba de Mann-Whitney y ejecutar la prueba.
6. Si la varianza es significativamente diferente, utilice la prueba ANOVA de Kruskal Wallis como prueba estadística. Seleccione estadísticas > Pruebas no paramétricas > prueba de Kruskal Wallis ANOVA y ejecutar la prueba.

Resultados

Con nlsGPS1, es posible medir niveles de₄ GA celulares en tejidos susceptibles a las imágenes de fluorescencia, incluyendo ápices e hipocotilos crecido oscuro (figura 2). En la raíz de Arabidopsis , el gradiente de relación de emisión nlsGPS1 es indicativo de niveles bajos de GA en la zona meristemática y división y altos niveles de GA en la última zona de elongación (figura 2A y 2B). En contraste, un gradiente de relación de emisión no se observó en las raíces nlsGPS1-NR, lo que sugiere que el gradiente de GA endógeno no es un artefacto (figura 2 y 2D). Un gradiente de relación de emisión de nlsGPS1 se formó también en hipocotilos crecido de oscuro, con niveles bajos en los cotiledones y el gancho apical y niveles altos en la región basal rápidamente alarga el hipocótilo (Figura 2E y 2F). En contraste, un gradiente de relación de emisión no se observó en los hypocotyls nlsGPS1-NR (figura 2 y 2 H). Tanto en las raíces de Arabidopsis las células hipocótilo cultivados en oscuridad, acumulación endógena de GA correlacionada con la tasa de elongación celular.

Además, exógeno suministrado GA₄ se acumula preferentemente en la zona de alargamiento en comparación con la zona de división de la raíz de Arabidopsis (figura 3), indicando que nlsGPS1 puede utilizarse para estudiar GA endógeno y exógeno creación de patrones.

Durante tiempo curso experimentos, nlsGPS1 las plántulas se colocaron en cámaras pegajoso diapositiva y perfundidas con MS ¼ líquido, seguido de un tratamiento con 0.1 μm GA₄ por 30 min. El video muestra una acumulación más rápida de exógeno GA₄ en la zona de elongación radicular en comparación con la zona de la división (Video 1).

Figura 1: preparación para la proyección de imagen confocal de la muestra. Estos paneles muestran una representación esquemática de la preparación de la muestra (A) un experimento de estado estable, (B) antes y después exógeno GA₄ tratamientos y (C) un experimento de curso de tiempo de tratamiento con pegajoso-diapositivas (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El gradiente de la GA en las raíces de Arabidopsis e hipocotilos crecido oscuridad. Imágenes bidimensionales de nlsGPS1 (A) y (C) nlsGPS1-NR raíces fueron analizados utilizando el software ImageJ e imágenes tridimensionales de nlsGPS1 (B) y (D) nlsGPS1-NR se analizaron mediante un comercial tridimensional software de análisis de imagen. Ambos análisis demostraron un endógeno GA₄ degradado en las raíces de Arabidopsis . Imágenes bidimensionales de nlsGPS1 (E) y el hipocotilo de oscuro crecido nlsGPS1-NR (G) se analizaron utilizando el software ImageJ e imágenes tridimensionales de nlsGPS1 (F) y (H) nlsGPS1-NR se analizaron mediante la software de análisis de imagen tridimensional comercial. Ambos análisis demostraron un endógeno GA₄ degradado en hipocotilos crecido oscuro. La barra de LUT muestra la falsa coloración de ratios de emisión de nlsGPS1. Imágenes YFP están registrados como controles de expresión. Imágenes de hipocótilo se adquirieron dos posiciones de la etapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: el gradiente exógeno de GA en raíces. La primera exposición de dos paneles (A) bidimensional y (B) imágenes tridimensionales de una raíz de nlsGPS1 antes y 20 minutos después del tratamiento de exógeno GA₄ (1 μm). Imágenes YFP están registrados como controles de expresión. El ver dos paneles (C) la media y desviación estándar y (D) parcela beeswarm y cuadro de ratios de emisión de nlsGPS1 de núcleos de la zona de elongación (la región que se define con un marco blanco). En la zona de elongación, la proporción de emisiones de nlsGPS1 fue significativamente mayor después del tratamiento de₄ GA (prueba U de Mann-Whitney, *** P-valor < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: experimento de perfusión de raíz nlsGPS1 con tobogán pegajoso. Este video muestra imágenes tridimensionales de las nlsGPS1 inundada con MS ¼ líquido y tratada con 0.1 μm GA₄ por 30 min. En el curso del tiempo, la proyección de imagen fue adquirida cada 10 minutos durante 3 horas con los siguientes intervalos: 30 min de solución falsa (marco t = 1, t = 2, t = 3), 30 min de tratamiento de₄ GA (marco t = 4, t = 5, t = 6), 2 h de mock para resolución (marco t = 7 t = 18) solución. Antes de la adquisición, la muestra fue inundada con la falsa solución para 2 h. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Discusión

El nlsGPS1 de biosensores basados en traste GA provee un método cuantitativo para informar y medir gradientes de hormona GA en las plantas pluricelulares. Biosensores basados en traste pueden cuantificar dinámica con una mejor resolución espacio-temporal sobre detección por espectrometría de masas y medición indirecta por reporteros transcripcionales o señalización de la proteína-degradación-métodos basados en^{12, 13}. Alta resolución imágenes celulares en diversos tipos de tejido pueden producir conocimientos significativos en GA biología y chispa nuevas hipótesis con respecto a la regulación y función de las acumulaciones de GA en un contexto multicelular. Por ejemplo, monitorear los cambios en el biosensor nlsGPS1 en específico GA biosintético, catabólica y mutantes de transporte, así como durante las perturbaciones spatiotemporally inducidas, puede ser muy informativo para probar específicamente cómo se establecen gradientes de GA en la raíz y la raíz de la dirección de la célula las respuestas a gradientes de GA. El sensor podría utilizarse en otras especies modelo y cultivo para comprobar la conservación de los mecanismos que controlan el control de GA-mediados de floración, germinación de la semilla y alargamiento celular.

Los pasos críticos en la proyección de imagen basada en el traste del biosensor nlsGPS1 son que, 1) los píxeles no deben saturarse durante el análisis cuantitativo de traste, 2) proyección de imagen parámetros como "detector de ganancia" se deben mantener constantes para la emisión de donantes (DxDm) y adquisiciones de emisión (DxAm) de aceptador, 3) líneas de nlsGPS1-NR de control deben utilizarse para descartar artefactos y 4) las muestras deben estar preparadas para minimizar la deriva y cuestiones de cambio focal. Además, las condiciones ambientales en que se cultivan las muestras son importantes para controlar ya que los niveles de GA son sensibles a condiciones ambientales como la luz de la duración e intensidad de luz^{14,15,16 ,17}. Una limitación clave de este tipo de análisis es que un alto cociente signal-to-noise es necesario para la proyección de imagen debido al aumento de ruido inherente en la proyección de imagen radiométrica. Así, nlsGPS1 la proyección de imagen no será útil para los tejidos y órganos que no son susceptibles a la microscopía de fluorescencia radiométrica con proteínas fluorescentes cian y amarillo, por ejemplo, los tejidos más profundos donde mal se detectan proteínas fluorescentes. Por otra parte, lecturas radiométrica se prefieren a menudo sobre lecturas de intensiometric, porque un control interno es útil para descartar artefactos derivados de cambios en la expresión de biosensor, estabilidad, brillo o detectabilidad en una determinada célula, tejido , o condición. TRASTE por ejemplo proyección de imagen de biosensores y análisis de imagen también se han utilizado para estudiar una variedad de ligandos en una variedad de tejidos^{5,6,18,19,20,}. Los experimentos de proyección de imagen y análisis de imagen divulgados aquí pueden modificarse para adaptarse a nuevos métodos de imágenes, tales como microscopia de la ficha técnica de iluminación, que podría generar nuevos conocimientos en, por ejemplo, más profunda raíz-tipos de tejidos.

El biosensor de primera generación nlsGPS1 es un sensor de alta afinidad que proporciona un alta resolución mapa de gradientes de GA que puede informar también sobre aumento intracelular siguiendo tratamientos exógenos de GA GA. Una de las limitaciones actuales de nlsGPS1 es que el sensor no es rápidamente reversible y, por lo tanto, los informes no en niveles de estado estacionario GA pero, probablemente, en la reciente GA concentración máxima en la solución de interés. La tasa de rotación precisa para el sensor es también conocido y esto, combinado con baja reversibilidad, impide la detección de agotamientos endógenos de GA que puede estar pasando a minutos a una pocas horas en algunos tipos de tejidos. También es importante tener en cuenta que nlsGPS1 tiene una alta afinidad para el GA₄ (K_d = 24 nM) en comparación con otras formas de GA (GA₃ K_d= 240 nM, GA₁K_d = 110 nM) cuando otros bioactivos GAs ^{la proyección de imagen 7}. las generaciones futuras de biosensores de GA pueden diseñarse para aumentar reversibilidad manteniendo alta afinidad o exhiben especificidades diferentes para los diversos precursores, bioactivos, o catabólica GAs. 

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
nlsGPS1 Col0 semillas de Arabidopsis	NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 semillas de Arabidopsis	NASC	N2107735
Giberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	se disuelve en EtH 70% y se mantiene a -20 ° C
solución de hipoclorito de sodio (lejía)	Fisher S/5040	HSRA 064
Cloruro de hidrógeno HCl	Sigma	31434
cinta de microporos	3M	1530-1
ibidi portaobjetos adhesivos	Ibidi	81128	Luer 0.1 para la imagen
de raíces ibidi portaobjetos pegajosos	Ibidi 80168		Luer 0.2 para la imagen
de hipocótilocubreobjetos de vidrio para portaobjetos pegajosos	Ibidi	10812
Codo Conectores Luer	Ibidi	10802
tubo de silicona	Ibidi	108401
Luer Lock Conector	Ibidi	10826
jeringa programable	World Precision Instruments	AL-1000
Grasa al vacío	Sigma	18405
Sales basales de Murashige y Skoog	Duchefa	M0221
Planta de agar, 1 kg	Melford	P1001
Portaobjetos de microscopio Bordes rectificados, 76 mm x 26 mm, 1,0 mm a 1,2 mm de espesor	Fisher Scientific	12383118
Cubreobjetos n.º 1 1/2 vidrio 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Jeringa 20	mL Fisher Scientific
Cinta de papel quirúrgico 3M Micropor	Fisher Scientific	12787597
Hidróxido de potasio, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Etanol	absoluto Pinzas de	10428671
Relojero 5 StSteel	Scientific Suministros de laboratorio	INS4340
Tijeras, 125 mm, acero inoxidable	Fisher Scientific	12338099
Reductor de ajuste de 0,5 a 1,6	Ibidi	10829
Leica SP8			Microscopio láser confocal 1
Zeiss LSM 780			Microscopio láser confocal 2
Imaris	Bitplane		Software
			Software de análisis de imágenes
Software de análisis estadístico	OriginPro	Origin Lab