Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

Resumen

Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.

Resumen

Inspirado en el mito de caballo Trojan Homer´s, hemos diseñado el patógeno del maíz Ustilago maydis para proporcionar proteínas secretadas en el apoplasto maíz permitiendo análisis fenotípico en vivo. Este método no se basa en la transformación de maíz pero explota capacidades secretoras de patógenos y genética microbiana. En este documento, permite la inspección de en vivo entrega proteínas secretadas con alta resolución espaciotemporal en diferentes tipos de sitios de infección y los tejidos. La estrategia del caballo de Troya puede ser utilizada para complementar transitorio maíz fenotipos de pérdida de función, para caracterizar funcionalmente dominios de la proteína, para analizar los efectos de la proteína objetivo, o para el estudio de sobredosificación de proteína juego, convirtiéndolo en una poderosa herramienta estudios de la proteína en el sistema de cultivo de maíz. Este trabajo contiene un protocolo preciso sobre cómo generar una cepa de caballo de Troya seguida por protocolos estandarizados infección aplicar este método a tres tipos de tejido diferentes de maíz.

Introducción

El patógeno foliares Ustilago maydis es el agente causativo del maíz smut enfermedad¹. Infecta todas las partes aéreas de maíz resultando en tumores grandes que contienen esporas de melanized, negro. A nivel mundial, se estima en U. maydis causa una pérdida anual de alrededor del 2% de la producción de maíz, mientras que los tumores son apreciados como un manjar gastronómico en México. Infección de la planta se inicia por un apresorio que secreta enzimas lisis celular para penetrar la primera capa de células epidérmicas maíz. De un sitio de infección primaria, U. maydis crece intracelularmente e intracelular, invaden ....

Protocolo

1. construcción de un caballo de Troya de U. maydis

Nota: Vea la figura 1.

1. Amplificar un gen de interés a partir de maíz cDNA utilizando cartillas gene-específicas y una revisión ADN polimerasa. Clonar el producto primario de la polimerización en cadena y transforman la construcción de e. coli siguiendo las instrucciones del proveedor de plásmido. Verifique que el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación antes de los próximos pasos de la clonación.
   Nota: Especificaciones de PCR necesitan ser optimizado debido a la ....

Resultados

Construcciones para los experimentos de caballo de Troya de U. maydis se clonan en el plásmido p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gene de interés mCherry-Ha. El maíz gen de interés se fusiona a un reportero de fluorescencia mCherry y un epitopo HA-etiqueta. La expresión de la proteína de fusión es bajo control del promotor U. maydis Umpit2 que específicamente se activa .......

Discusión

Investigación de cultivo moderno exige protocolos de análisis molecular en genética y niveles de la proteína. Accesibilidad genética a través de transformación no es disponible o ineficientes y lentos para más especies de cultivos como el maíz. Por otra parte, herramientas genéticas confiables tales como sistemas de reportero promotor son escasos, lo que hace difícil para el estudio de la función de la proteína in situ de alta resolución espaciotemporal en sitios tisulares distintos. Apoplasto proteínas pueden e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 2 ml	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 aguja hipodérmica	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
ADNc del maíz			del tejido del maíz que expresa el gen del interrest
Carbón vegetal	Sigma-Aldrich	05105
Microscopio			uso de equipos disponibles localmente
Cubeta (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubadora-agitadora ajustada a 28 & grados; C, 200 rpm			use equipo disponible localmente
Microscopio óptico con aumento			use equipo disponible
localmenteNco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			por favor contacte al autor correspondiente
Pipeta Pasteur (vidrio, punta larga)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	se puede cambiar por otros vectores de clonación básicos como pENTR o pJET
Agar patata dextrosa	VWR	90000-745
Uso de bolígrafos			Equipos disponibles localmente
Uso de espectrofotómetros			equipos disponibles
localmenteSsp I	NEB	R0132
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
T4 ADN ligasa	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
em>Xba I	NEB	R0145
Extracto de levadura	BD	212750

de barrido láser confocal de 400 veces Sharpie <