Artículo de método

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

DOI:

10.3791/58754

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7 de enero de 2019

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1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canales de potencial receptor transitorio (TRPCs) de la subfamilia TRP canónica son canales de cationes no selectivos que juegan un papel esencial en la homeostasis del calcio, entrada de calcio particularmente tienda que funciona, que es fundamental para mantener el funcionamiento adecuado del liberación de la vesícula sináptica y vías de señalización intracelular. Por consiguiente, los canales TRPC han sido implicados en una variedad de enfermedades incluyendo las enfermedades cardiovasculares como la hipertrofia cardiaca, trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y trastornos neurológicos como la ataxia espinocerebelosa. Por lo tanto, canales TRPC representan una diana potencial farmacológica en las enfermedades humanas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de bloquear estos canales aún no están claros. La dificultad en la obtención de grandes cantidades de proteína purificada, homogénea y estable ha sido un factor limitante en los estudios de determinación de estructura, particularmente para las proteínas de membrana mamíferos como los canales de ion TRPC. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión a gran escala de proteínas de la membrana del canal de ion mamíferos utilizando un sistema de transferencia de genes de baculovirus modificados y la purificación de estas proteínas por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Además, presentamos un protocolo para recoger imágenes de microscopia del cryo-electrón de solo-partícula de proteína purificada y utilizar estas imágenes para determinar la estructura de la proteína. Determinación de la estructura es un método eficaz para la comprensión de los mecanismos de control y función de canales iónicos.

Introducción

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Calcio está implicado en procesos celulares más que incluyen señalización cascadas, control de la transcripción, liberación de neurotransmisor y hormona molécula síntesis1,2,3. El mantenimiento homeostático del calcio libre citosólico es crucial para la salud y la función de las células. Uno de los principales mecanismos de homeostasis del calcio intracelular es la entrada de la tienda que funciona de calcio (SOCE), un proceso en el que agotamiento de calcio almacenado en los provocadores de la retículo endoplásmico (ER) la apertura de canales iónicos en la membrana plasmática para facilitar la reposición de calcio ER, que puede utilizarse en la señalización más4,5,6. Canales potencial receptor transitorio (TRPCs), que son permeables al calcio canales pertenecientes a la superfamilia TRP, se han identificado como un importante participante en SOCE7,8,9 .

Entre los siete miembros de la familia TRPC, TRPC3, TRPC6 y TRPC7 forman un subgrupo de homólogo, y son únicos en la capacidad de ser activado por el lípido secundaria mensajero diacilglicerol (DAG), un producto de degradación de los lípidos señalización fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2)10,11. TRPC3 es altamente expresada en el músculo liso y en las regiones cerebrales y cerebelosas del cerebro, donde desempeña funciones esenciales en la señalización de calcio que afectan a la neurotransmisión y neurogénesis12,13. Disfunción de TRPC3 se ha relacionado con trastornos del sistema nervioso central, enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres como el adenocarcinoma ovárico14,15,16. Por lo tanto, TRPC3 es prometedor como objetivo farmacéutico para el tratamiento de estas enfermedades. El desarrollo de fármacos específicamente dirigidos en TRPC3 ha sido limitado por la falta de comprensión de sus mecanismos de activación molecular, incluyendo lípidos vinculante sitios17,18. Hemos reportado la primera estructura de la atómico-resolución del humano TRPC3 canal (hTRPC3) y sus sitios de unión de lípidos dos en un estado cerrado, proporciona penetraciones importantes en estos mecanismos19.

El factor clave para determinar la estructura de una proteína de membrana de alta resolución es obtener proteína de alta calidad. La proyección correspondiente de la expresión y purificación de las condiciones necesarias para obtener proteína de alta calidad puede ser un esfuerzo costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí presentamos un protocolo que describe en detalle cómo identificar las condiciones óptimas para la expresión y purificación de hTRPC3, que se comportaron mal en nuestro análisis inicial. Presentamos varios puntos claves acerca de cómo solucionar problemas y optimizar el comportamiento de la proteína, que pone una fundación sólida para la cryo-electrón de estudios de la microscopia (cryo-EM). Utilizamos un baculovirales modificada generación de vectores (pEG), desarrollado por Gouaux y colegas, que se ha optimizado para la detección del análisis y eficiente generación de baculovirus en células de mamífero de20. Este método de expresión es apropiado para la rápida y rentable la sobreexpresión de proteínas en la membrana de la célula mamífera. Combinamos el uso de este vector con una tamaño-exclusión de fluorescencia-detección basada en cromatografía (FSEC) preselección método21. Este método utiliza una etiqueta de la proteína verde fluorescente (GFP) sobre el constructo de interés y mejora la visualización de la proteína objetivo en pequeños celulares solubilizadas las muestras. Esto permite la proyección de la estabilidad de la proteína en presencia de diferentes detergentes y aditivos, con mutaciones de thermostabilizing y permite el uso de un pequeño número de células de transfección transitoria en pequeña escala. De esta manera, una multitud de condiciones puede someterse rápidamente antes de pasar a una purificación de proteínas a gran escala. Expresión, detección y purificación, presentamos un protocolo de obtención y procesamiento de imágenes de cryo-EM para generar una determinación estructural de novo de la proteína. Creemos que los enfoques descritos aquí servirá como un protocolo generalizable para estudios estructurales de TRP canales receptores y otras proteínas de membrana.

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Protocolo

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1. transformación de células competentes DH10α para producir Bacmid ADN

  1. Sintetizar el gen de interés y subclone en una versión modificada del vector pEG que contiene un doble strep-tag, etiqueta His8 y GFP con un sitio de la hendidura de la trombina en el N terminal (pFastBacI)20.
  2. Transformar células competentes mediante la adición de 5 ng de plásmido que contiene un gen deseado en pFastBacI a 50 μL de DH10α células de 1,5 mL del tubo e incuban por 10 min en hielo. Calor del choque las células para 45 s a 42 ° C. Añadir 200 μL de caldo super óptima con medio represor catabólico (SOC) en el tubo e incubar durante 4-8 h a 37 ° C en un agitador orbital a 225 rpm.
  3. La placa 5 μL de las células en una placa de agar bacmid LB (50 kanamicina μg/mL, 7 μg/mL gentamicina, agar tetraciclina, Bluo-gal de 100 μg/mL y 40 μg/mL isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido [IPTG], 10 μg/mL).
  4. Incube la placa durante 48 h a 37 ° C.
    Nota: Las colonias de manchas de indicador de Bluo-gal que todavía expresan lacZ (inserción del vector sin éxito), que permite selección de colonias blancas (transformadas con éxito).
  5. Seleccione cuidadosamente una colonia blanca aislada, evitando cualquier colonias blancas que están en contacto con las colonias azules y crecen las células durante la noche en 6 mL de medio de bacmid LB (50 kanamicina μg/mL, 7 μg/mL gentamicina, tetraciclina de 10 μg/mL) a 37 ° C en un agitador orbital a 225 rpm.

2. bacterias preparación para aislamiento de DNA de Bacmid

  1. Para aislar el ADN bacmid, desactivación de células de Escherichia coli durante 10 min a x 2880 g.
  2. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de solución de resuspensión celular de la miniprep kit (véase Tabla de materiales) por pipeteo. Asegúrese de que el sedimento se suspende completamente y de forma homogénea. Entonces, transfiera la suspensión celular en tubos de 1,5 mL.
  3. Añadir 200 μL de la solución de lisis celular de la miniprep kit y mezclar invirtiendo el tubo varias veces. Incubar hasta 5 min a temperatura ambiente (RT) para lisar las células. Añadir 200 μL de solución de neutralización de la miniprep kit y mezclar invirtiendo el tubo varias veces para detener la reacción de lisis.
  4. Desactivación durante 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Recoger 600 μL de sobrenadante en un tubo de 2 mL. Añadir 600 μL fenol: cloroformo: isoamílico solución de alcohol (véase Tabla de materiales) y mezcla bien para extraer el ADN del resto de los productos de la lisis de la célula.
    PRECAUCIÓN: Solución de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol es tóxico por inhalación, contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar quemaduras químicas y pueden ser cancerígeno. Use guantes y una bata abotonada. Trabajar en una campana de humos. Disponer adecuadamente de estos residuos peligrosos.
  5. Girar el tubo por 10 min a 21130 x g en una centrífuga de mesa. Aparecerán dos fases líquidas separadas. Cuidadosamente transferir 300 μL de la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir 600 μL de etanol al 100% para lavar el DNA. Invierta suavemente el tubo para mezclar.
    Nota: No no agitar con vortex, ya que esto puede distorsionar bacmid ADN.
  6. Tubos frescos colocándolos en un congelador de-20 ° C durante 10 minutos giran por 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y mantener el pellet de DNA.
  7. Añadir 1 mL de etanol al 70% para lavar el pellet. Invierta suavemente el tubo para mezclar. Centrifugado por 10 min a 21.130 x g en una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y seque el precipitado al aire durante aproximadamente 5 minutos o hasta que el líquido no es visible en el tubo y el pellet de DNA se convierte en traslúcido.
  8. Resuspender el precipitado seco en 50 μl de estéril, libre de ADNasa, agua desionizada. Medir la concentración de ADN.
    Nota: No congelar ADN bacmid. Almacenar a 4 ° C durante hasta varios días.

3. transfección de células de insecto Sf9 con Bacmid para producir Baculovirus P1

  1. Semilla 0.9 x 106 células Sf9/pozo en 2 mL de medio apropiado (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6. Incube las células a 27 ° C por 20 min promover el apego a la placa.
    PRECAUCIÓN: Los cultivos celulares son un peligro biológico. Trabajar en una campana de flujo laminar aprobadas utilizando condiciones asépticas y compruebe las directrices institucionales y gubernamentales para ropa de protección recomendada y correcta eliminación de los residuos antes de realizar los experimentos.
  2. Después de la fijación, añadir 8 μl de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) a 100 μl de los medios de comunicación para cada pocillo de la 6 placa bien ser transfectadas en un tubo estéril. Añadir 6 μg de bacmid ADN a 100 μl de medio en un tubo estéril separado. Incubar 5 min a RT. combinar las dos soluciones e incubar durante 45 min a TA.
  3. Vuelva a colocar el medio en los 6 pozos con 2 mL de medio fresco. Añadir la mezcla del paso anterior a cada uno bien gota a gota (200 μL por pozo). Muévalo suavemente la placa para asegurar una mezcla de la solución de la transfección en el medio.
    Nota: No agitar ni agitar la placa porque esto puede causar que las células separar.
  4. Incube las células durante 5 días (120 h) en una incubadora humidificada de 27 ° C. Comprobar la fluorescencia de GFP antes de la cosecha para comprobar que el virus se está produciendo en un gran porcentaje de las células; el porcentaje es bajo, aumenta el tiempo de incubación según sea necesario (ver figura 1).
  5. Recoger el sobrenadante que contiene virus del P1 (aproximadamente 2 mL de cada pozo). El medio que contiene virus de P1 en tubos de 2 mL con una jeringa de 3 mL y pequeño 0,2 μm filtro del filtro. Añadir estéril de suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de 1%.
    Nota: Esta acción de virus P1 debe almacenarse a 4 ° C y protegerse de la luz.

4. infección de células de insecto Sf9 con Baculovirus P1 para producir Baculovirus P2

  1. Preparar 200 mL (o volumen) de las células Sf9 en una concentración de 0.8 - 0.9 x 106 células/mL en medio apropiado (véase Tabla de materiales) en un erlenmeyer cultura de fondo plano de tamaño suficiente.
    Nota: Para la cultura de la suspensión, el volumen utilizado no debe exceder 40% de la capacidad total del matraz.
  2. Añadir 1:2500 relación (v/v) de la acción de virus P1 de 3,5 a la cultura de suspensión de células Sf9. Incubar durante el tiempo de expresión del virus óptima (generalmente 48-120 h dependiendo de la construcción de proteínas) a 27 ° C en un agitador orbital a 115 rpm.
    Nota: La expresión de virus relativa puede determinarse mediante la visualización de la fluorescencia de GFP del virus en una muestra de la cultura.
  3. Centrifugar la suspensión celular por 40 min a 11.520 x g y recoger el sobrenadante que contiene virus de P2. Filtrar el sobrenadante utilizando desechables 0,2 μm filtros. Añadir equipos a una concentración final de 0,5%.
    Nota: Este virus P2 deben almacenarse a 4 ° C y protegido de la luz.
  4. Obtener un título para el virus P2 utilizando células de Sf9easy o un contador de virus.

5. infección de células mamíferas HEK293 con Baculovirus P2 para expresión de proteínas a gran escala

  1. Preparar un volumen conveniente de HEK293 mamíferos suspensión cultivo celular (4-6 L se recomienda para la preparación de redes congelados) en una concentración de 3.5-3.8 x 106 células/mL en el medio de expresión (véase Tabla de materiales) suplementado con 1% (v / v) FBS estéril en frascos de cultivo de Erlenmeyer inferior desconcertado de tamaño suficiente.
    Nota: Para la cultura de la suspensión, el volumen utilizado no debe exceder 40% del volumen total del matraz.
  2. Agregar 8% (v/v) de la solución madre de virus P2 de paso 4.3 a la cultura de suspensión de células HEK293. Incubar a 37 ° C en un agitador orbital a 135 rpm.
  3. Añadir butirato de 10 mM en post-infección 12-18 h. Incubar durante el tiempo de expresión de la proteína óptimo (generalmente 36-72 h) a 30 ° C.
  4. Recoger las células por centrifugación durante 20 min a 2.880 x g. Lavar las células a resuspender en aproximadamente 100 mL tris-buffer salino (TBS) por litro de células cosechadas. Centrifugar nuevamente por 20 min a 2.880 x g y recoger el precipitado de células.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Gránulos de la célula pueden ser snap-congelado en nitrógeno líquido y almacenadas a-80 ° C hasta purificación.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar lesiones o quemaduras criogénicas. Puede causar quemaduras por congelación. Puede desplazar el oxígeno y causar asfixia rápida. Use guantes aislantes de frío y careta protectora.
  5. Recoger cosechas pequeñas 1 mL en diferentes puntos del tiempo y solubilizar por 2 h a 4 ° C con oscilación o agitación en presencia de diferentes detergentes y aditivos. Estas pequeñas muestras solubilizadas de celulares pueden ser clarificadas por ultracentrifugación a 235.000 × g por 10 min a 4 ° C y correr como una muestra de 30 μL en una columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) (véase Tabla de materiales) para determinar el mejor momento para expresión y las mejores condiciones de solubilización.
    Nota: En el caso de hTRPC3, esta proyección incluye buffers diferentes con valores de pH de 4.0-9.5 y concentraciones de sal de 50-500 mM; diferentes composiciones iónicas (como MgCl2 o NaCl); detergentes diferentes con valores de (CMC) de la concentración micelar crítica de 0.1 - 20 mM; reducción de aditivos tales como el Ditiotreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina y β-mercaptoetanol; y los quelantes del calcio ácido añadido etilendiaminotetracético (EDTA).

6. purificación de la proteína hTRPC3 del precipitado de células congeladas

  1. Descongelar el precipitado en tampón que contiene 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptin, pepstatin 2 m m A, y digitonin 1%, utilizando 100 mL de buffer por cada litro de las células cosechadas. Una vez descongelado, asegurar la homogeneidad de la solución por pipeteo o agitación. Permiten para solubilizar por 2 h a 4 ° C en un matraz sumergido en hielo con un stir bar giratorio.
  2. Eliminar restos celulares por ultracentrifugación a 235.000 × g durante 1 h a 4 ° C. Verificar la cantidad de proteína mediante la ejecución de una muestra de 30 μL en una columna de s (véase Tabla de materiales) por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y visualizar la proteína diana de la GFP señal de salida.
  3. Incubar la proteína solubles (sobrenadante) con resina de afinidad de cobalto de 1-2 h a 4 ° C. Verificar proteínas de unión a la resina ejecutando una 30 muestra μL en una columna de seg.
    Nota: Si se ha producido la Unión a proteínas, el objetivo del etiquetado proteína GFP se conservarán en la columna, que no se encuentran en el flujo a través. Por lo tanto, no hay señal GFP estará presente en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo cuando el flujo a través de HPLC.
  4. Lavar la resina con 10 volúmenes de columna de búfer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 15 mM y 0.1% digitonin). Si hay pérdida de la proteína ejecutando una 30 muestra μL en una columna de seg.
    Nota: Si se ha producido pérdida de la proteína de la columna, el objetivo del etiquetado proteína GFP se encontrará en el tampón de lavado que ha pasado sobre la columna. Por lo tanto, la señal GFP estará presente en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo cuando el tampón de lavado se ejecuta en HPLC. Si se ha producido pérdida de la proteína, la concentración del imidazol el tampón de lavado deba reducirse para evitar perturbar su enlace de la etiqueta a la columna de afinidad.
  5. Eluir la resina hTRPC3 con tampón (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 250 mM y 0.1% digitonin). Añadir trombina en una 1:20 fracción molar (para hender la etiqueta GFP) y añadir 10 mM EDTA (un agente estabilizador de hTRPC3) a la muestra eluída e incubar durante 3 h a 4 ° C. Comprobar que la proteína ha sido eluida ejecutando 90 μL de una muestra diluida 1: 100 en una columna de segundos y verificar la presencia de una señal GFP en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo.
    Nota: en este punto, la señal de triptófano de las proteínas totales en la elución puede también verse. Sólo la proteína de purificados por afinidad de objetivos permanecerá en la elución y la GFP y triptófano señales serán cerca de idéntico perfil. Si la proteína diana no se ve en gran cantidad en la elución pero no se perdió en el flujo o el lavado, la proteína probablemente ha permanecido ligada a la columna y puede eluyó con una mayor concentración de imidazol en el búfer.
  6. Concentrar el efluente a 500 μL o menos en un filtro centrífuga de 15 mL 100K tubo (véase Tabla de materiales) por giro a 2.880 x g a 4 ° C en incrementos de 5 minutos. Resuspender las proteínas transfiriendo la solución hacia arriba y hacia abajo entre giros para evitar overconcentrating.
    Nota: Centrífuga tiempo puede ser acortado como aproxima el volumen el volumen final deseado.
  7. Cargar el concentrado en una columna de SEC en tampón (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0,1% digitonin). Ejecutar.
  8. Combinar fracciones de pico que contiene el tetrámero TRPC3 intacto, como visualizado por la señal de absorbancia de UV y se concentran otra vez a una concentración final de al menos 5 mg/mL.

7. detección de proteínas por microscopía Tinción negativa

  1. Encienda la máquina de la descarga del resplandor. Configurar el programa para la descarga de una cuadrícula recubiertas de carbón utilizando argón y oxígeno para 30 s. ejecutar el programa para hacer la capa de carbón en rejillas de malla 400 cobre hidrofílico antes de la adición de la solución de proteína.
  2. Crear gotas cinco 40 μL de agua estéril y gotas de dos 40 μL de solución de formato de uranilo de 1% (en la película de laboratorio, papel de cera o una superficie similar, véase Tabla de materiales). Tome la rejilla de paso 7.1 y añadir 2,5 μL de proteína de 5 mg/mL (50-200 μM) la muestra en el lado oscuro y déjelo reposar 1 minuto.
  3. Después de 1 min, secar la rejilla usando papel de filtro. No toque el papel de filtro directamente a la superficie de la rejilla; en cambio, llevar el papel al borde de la gota líquida y permita que la acción capilar extraer el líquido de la red en el papel de filtro.
  4. Sumerja la rejilla en primera gota de agua. Secar con papel de filtro y repetir con las gotas restantes de agua y la primera gota de formato de uranilo. Permite la segunda gota de sit formato de uranilo durante 1 minuto y luego secar con papel de filtro. Permita que la rejilla de aire seco (1 min.) antes de almacenar.
    Nota: Este protocolo de tinción puede no ser ideal para todas las combinaciones de proteína-detergente. Diferentes concentraciones de formato de uranilo manchan y longitudes diferentes de tiempo para la exposición de la mancha deben analizarse si los pasos anteriores no proporcionan una mancha con buen contraste.
  5. Las rejillas en un microscopio electrónico de la imagen (véase Tabla de materiales) para comprobar la calidad de la partícula de proteína. Asegurar que las fotografías muestran numerosas partículas que son homogéneas en la distribución y apariencia general, mostrar buen contraste y coincide con el tamaño previsto de la proteína diana.
  6. Generar preliminar, baja resolución, de dos dimensiones (2D) clasificaciones con 50-100 fotografías (ver procesamiento de datos, paso 10) para comprobar las partículas representan diferentes puntos de vista de una sola estructura coherente.
    Nota: Micrografías y clases 2D preliminares de suficiente calidad, como se describe anteriormente, son un fuerte indicador de que el protocolo ha sido lo suficientemente optimizado para purificación de proteínas. Preparación y proyección de las redes de cryo-EM está garantizada en este punto.

8. preparación de la muestra EM

  1. Una rejilla de oro carbón perforado de descarga del resplandor (véase Tabla de materiales) como se describe en el paso 7.1.
  2. Aplicar 2.5 μL de la muestra de proteína de concentrado hTRPC3 (5 mg/mL) en la red. Secar la rejilla para 1.5 s utilizando una mancha de la fuerza de 1 y un tiempo de espera de 5 s en el 100% de humedad y 4 ° C, luego sumir la rejilla en etano líquido refrigerado por nitrógeno líquido utilizando una máquina de vitrificación.
    Nota: La humedad, temperatura, fuerza de blot, blot tiempo y aparece aquí el tiempo de espera fueron utilizados por hTRPC3 estudio19 los autores. Que necesiten ser cambiado para producir hielo vítreo óptimo para otras proteínas y detergentes.
  3. Pantalla congelada rejillas para condiciones de hielo óptimo utilizando un microscopio de cryo-EM (véase Tabla de materiales) y manualmente ver regiones de hielo (grid los cuadrados que aparecen más pequeños y más oscuros), thin ice (cuadrados de rejilla que aparecen más grandes y más brillantes) y medio de hielo .
    Nota: Hielo más grueso a menudo tiene más partículas, mientras que el hielo más delgado a menudo da mejor contraste y resolución. Investigación manual de uso de imágenes para determinar que hielo condiciones resultados en un número grande de partículas monodispersados con buen contraste y resolución. Una vez que se haya verificado la buenas condiciones, mover a la colección de imágenes en un microscopio de cryo-EM 300 kV.

9. recolección de datos EM

  1. Utilizando un programa de adquisición automatizada, grabar montones de imágenes en modo cuenta de súper-resolución con un tamaño de pixel desechado de 1,074 Å en un microscopio electrónico funciona a 300 kV con un aumento nominal de 130.000 X directo detector de electrones.
  2. Fraccionar dosis de cada imagen a 40 marcos con un tiempo total de exposición de 8 s, con 0,2 s por marco y una dosis de 6.76 e− Å s−2 −1 (valores de desenfoque nominal variados de 1.0 a 2.5 μm en el experimento de los autores).

10. EM informática

  1. Aplicar movimiento corrección de Resumen película pilas22 y estimar valores de desenfoque23 utilizando el software de procesamiento de datos (véase Tabla de materiales)24.
  2. Recoger las partículas de los micrográfos. Utilice estos recogido partículas para construir una clasificación libre de referencia 2D inicial usando el software24. Promedios de seleccionar clase 2D ideal para usar como plantillas para recoger partículas automatizada para el conjunto de datos.
  3. Compruebe la calidad de las partículas recogidas de auto y particulas mal manualmente. Utilizar múltiples rondas de clasificación 2D para limpiar las partículas cogidas.
  4. Generar un modelo inicial de25. Tema 2D recogido partículas tridimensionales (3D) clasificación (5 clases) usando simetría C1 y un filtro de paso bajo de reconstrucción inicial de 60 Å como un modelo de referencia. Determinar qué clases tienen características de alta resolución y combinan partículas dentro de dicha clase.
  5. Refinar aún más las partículas con el refinamiento local C4 simetría (en el caso de hTRPC3) aplicada y un límite de alta resolución para la alineación de la partícula a 4.5 Å26.

11. modelo de edificio

  1. Construir un modelo (véase Tabla de materiales para el software utilizado). Para hTRPC3, utilice el dominio transmembrana (TMD) del melastatin potencial transitorio del receptor 4 (TRPM4) 5wp6 de banco de datos (PDB) de proteínas de estructura como una guía27. Utilice los residuos voluminosos y la predicción de estructura secundaria guía de novo edificio.
  2. Tema del modelo inicial al refinamiento del espacio real con restricciones de estructura secundaria28. Examinar el modelo refinado y remodify según sea necesario (véase Tabla de materiales para el software utilizado) manualmente.
  3. Aplicar curvas de correlación (FSC) de cáscara de Fourier para calcular la diferencia entre el modelo final y el mapa de EM para la validación de la estructura refinada. Evaluar la geometría de los modelos atómicos (véase Tabla de materiales para el software utilizado)29,30.

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Resultados

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En la figura 1Ase muestran un Resumen esquemático del protocolo para la expresión y purificación de hTRPC3. Una imagen de la placa de bacmid de hTRPC3 con colonias blancas ideal, similares a la seleccionada para la purificación de la DNA del bacmid, se muestra en la figura 1B. Se encontró que 48 h es ideal para la tinción de Bluo gal claro manteniendo la presencia de colonias aisladas. Pico de producción de virus P2 para hTRPC3, ...

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Discusión

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Determinación estructural de proteínas por cryo-EM ha revolucionado el campo de la biología estructural en los últimos años, gracias al desarrollo de nuevas cámaras y algoritmos que acelera significativamente la determinación de la estructura de las proteínas que no cristalizar fácilmente, particularmente las proteínas de la membrana. A pesar de los avances recientes en la técnica de cryo-EM, la preparación de proteínas purificadas en calidad y cantidad suficiente para facilitar la calidad de imagen a menudo sigue siendo...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Zhao G. y X. Meng por el apoyo con la recopilación de datos en David Van Andel avanzado Cryo-Electrón microscopia Suite. Agradecemos el equipo VARI High-Performance Computing para soporte computacional. Damos nuestro agradecimiento a Floramo de J. Clemente, cuotas de D., N. Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth y Z. Ruan por comentarios que mejoraron grandemente este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoyo editorial para este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por VARI interna financiación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vector pEG BacMam (pFastBacI)addgene31488
células DH10 y alfa;Life Technologies10361-012
S.O.C. mediosCorning46003CRpara la transformación de células DH10 y alfa para Bacmid Placas de
cultivo BacmamTeknovaL5919para el cultivo de células DH10 y alfa transformadas
Agitador de incubación para células bacterianasInfors HTMultitron standard
Agitador orbital incubado para células de insectosThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 para células de mamíferosThermo-Fisher3951
Agitador orbital de sobremesaThermo-FisherSHKE416HPutilizado en Incubadora de CO2 Reach-in para células
de mamíferosIncubadoraVWR1535para placas bacterianas
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106para la extracción y purificación de plásmidos
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílicoInvitrogen15593031para la extracción de ADN
Sf9Life Technologies12659017células de insectos para la producción
de virus Medios Sf-900Gibco12658-027de células de insectos
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100para la transfección de células de insectos
lipofectamine 2000 Invitrogen11668-027para la transfección de células mamales
0,2 mm filtro de jeringaVWR28145-501para el filtrado del virus P1
matraces de filtro de 0,2 mm 500ml resevoirCorning430758para filtrar el virus P2
matraz de cultivo Erlenmeyer (fondo plano 2L)Gene MateF-5909-2000para el cultivo de células de insectos
matraz de cultivo Erlenmeyer (deflector 2L)Gene MateF-5909-2000Bpara el cultivo de células de mamíferos
nanodrop 2000 espectrofotómetroThermo-FisherND-2000para la determinación de concentraciones de ADN y proteínas
HEK293ATCCCRL-3022 células demamífero para la producción de proteínas
Expresión libre 293 MedioGibco1238-018medios de células de mamífero para la expresión de proteínas
Ácido butírico Sal de sodioAcros263195000para amplificar la expresión de proteínas
PMSFAcros215740500inhibidor de la proteasa
Aprotinina del pulmón bovinoSigma-AldrichA1153-100MGinhibidor de la proteasa
Clorhidrato de leupeptinaSigma-Aldrich24125-16-4inhibidor de la proteasa
pepstatina AFisher ScientificBP2671-250inhibidor de la proteasa
digitoninaEMD Millipore300410detergente - para solubilizar proteínas del
imidazolSigma792527para eluir proteínas de la columna de resina
Resina TALON635504 Clonetechpara la purificación por afinidad mediante
columnas de incesante His-tag superose6GE29091596; 29091597para HPLC y FPLC
Prominence Sistema de HPLCShimadzuVer a continuación
módulo de control"CBM20A
sistema de suministro de solventes"LC30AD
Detector de fluorescencia"RF20AXS
muestreador automático con refrigeración"SIL20ACHT
Sistema FPLC puro con fraccionadorAkta
trombina (alfa)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Alfa humanopara el escisión de la etiqueta GFP
Amicon Ultra 15 mL 100K tubo de filtro centrífugoMilliporeUFC910008para la concentración de proteínas
EDTAFisher E478500para la estabilización de proteínas
400 malla rejillas de cobre recubiertas de carbonoTed Pella Inc.01754-Frejillas para tinción negativa
Quantifoil rejilla de carbono agujereada (oro, 1.2/1.3  μ m tamaño/espacio del agujero, malla 300)Ciencias de la Microscopía ElectrónicaQ3100AR1.3rejillas para Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIpara la preparación de rejillas de muestras por etano líquido Congelación
nitrógeno líquidoDura-CylUN1977
gas etanoAirgasUN1035
Solarus Sistema de plasmaGatanModelo 950para la limpieza de rejillas antes
congelación de muestras Microscopio electrónico Tecnai SpiritFEIpara tinción negativa
Microscopio electrónico Talos ArcticaFEIpara el cribado y la obtención de imágenes de baja resolución de rejillas Cryo-EM
Microscopio electrónico Titan KriosFEIpara imágenes Cryo-EM de alta resolución
Software
Gautomatchhttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/para seleccionar partículas de las micrografías
software Relion 2.1https://github.com/3dem/relionconstruir clasificación en 2D y 3D
Software CryoSPARChttps://cryosparc.com/para generar un modelo de estructura inicial
El software Frealignhttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignpara refinar partículas
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/para construir un modelo
software MolProbityhttp://molprobity.biochem.duke.edu/para evaluar las geometrías del modelo atómico
software SerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/para la adquisición automatizada de pilas de imágenes en serie
softwareMortionCor2corrección de movimiento de pilas de películas sumadas
Software GCTFhttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/para medir los valores de desenfoque en pilas de películas
Phenix.real_space_refine https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlde softwarepara el refinamiento del espacio real del modelo 3D inicial
células medios de membrana modular de El de http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html para la

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