Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.
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Artículo de método
Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco
En este artículo
Resumen
Resumen
En las células vivas, procesos como la formación de adherencias implican grandes cambios estructurales en la membrana plasmática y el interior de la célula. Para poder visualizar estos eventos altamente dinámicos, se combinaron dos técnicas de microscopía de luz complementarias que permiten la proyección de imagen rápida de muestras vivo: girar a microscopía de disco (SD) para el registro del volumen rápido y de alta resolución y reflexión interna total Microscopía de fluorescencia (TIRF) para localización precisa y la visualización de la membrana plasmática. Aparecerá un protocolo de imagen integral y completado para guiar a través de la preparación de la muestra, calibración de microscopios, formación de la imagen y adquisición, dando por resultado varios color SD-TIRF de serie con alta resolución espacio-temporal. Todos pasos post procesado de imagen necesario para generar multidimensional vivo de conjuntos de datos, es decir, registro y combinación de los canales individuales, se proporcionan en una macro por escrito para el software de código abierto ImageJ. La proyección de imagen de proteínas fluorescentes durante la iniciación y maduración de los complejos de adhesión, así como la formación de la red del citoesqueleto de actina, fue utilizado como una prueba del principio de este nuevo enfoque. La combinación de microscopia de alta resolución 3D y TIRF proporciona una descripción detallada de estos procesos complejos en el entorno celular y, al mismo tiempo, localización precisa de las moléculas asociadas a membrana detectada con una alta relación de señal a fondo.
Introducción
Nuestros días, técnicas de microscopía de luz proporciona la proyección de imagen estupendo de alta resolución en fijo y vida ejemplar están desarrollando rápidamente. Técnicas de súper-resolución como estimularon emisión microscopía de iluminación de agotamiento (STED), estructurado (SIM) y microscopía de localización de foto activación (PALM) o microscopía directa reconstrucción óptica estocástica (tormenta), respectivamente, son disponible en el mercado y permiten la proyección de imagen de estructuras subcelulares que muestra detalles casi en la escala molecular1,2,3....
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Protocolo
1. preparación de las células
- Dos días antes del experimento, la semilla 3 * 105 HeLa o NIH3T3 células en 2 mL de medio de cultivo completo por pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos. Asegúrese de que las células se manejan en una campana de flujo laminar a lo largo de este protocolo.
- Un día antes del experimento, preparar los reactivos de transfección según las recomendaciones del fabricante o un protocolo determinado empíricamente, por ejemplo:
- Diluir 1 μg de RFP-Lifeact y 1 μg de YFP-vinculina en un total de 200 μL de medio de suero reducido. Vórtice el reactivo de transfección brevemente, añadir 4 μL a 200 μ....
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Resultados
Para demostrar el potencial de la proyección de imagen de SD-TIRF, que un ensayo fue desarrollado debe revelar la organización espacio-temporal de complejos de adhesión célula-matriz y su interacción con el citoesqueleto durante la adhesión celular. Por lo tanto, adherente HeLa o, alternativamente, NIH3T3 células fueron transfectadas con YFP-vinculina y RFP-Lifeact de 18-24 h, tripsinizaron y semillas en platos de fondo de vidrio recubierto de fibronectina. Estas líneas celulares fueron e.......
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Discusión
En este trabajo se presentó la primera aplicación exitosa de la SD y TIRF microscopia en una configuración conveniente para llevar a cabo experimentos imágenes de células vivas, es decir, las tasas de adquisición alto como 2 pilas de imagen de SD-TIRF por minuto a 3 alturas diferentes posiciones, correspondientes a un total de 168 marcos (alrededor de 3 fotogramas por segundo), fueron adquiridas. Algunos microscopios TIRF SD que fueron describen12,13, pr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos enormemente a la comunidad científica de la Universidad médica Center Hamburg-Eppendorf para apoyarnos con las muestras para evaluación. Es decir, agradecemos Sabine Windhorst células NIH3T3, Andrea Mordhorst de YFP-vinculina y Maren Rudolph de RFP-Lifeact.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio > < y accesorios SD-TIRF fuerte Visitron Systems Ti con sistema >de | |||
| enfoque perfecto | Nikon | Soporte de microscopio invertido | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Unidad de disco giratorio en configuración de doble cámara | |
| Escáner Roper Scientific | TIRF/FRAP | ||
| Evolve | Cámaras Photometrix | EM-CCD | |
| Etapa PiezoZ Ludl | Electronic Products | Etapa Z motorizada | |
| Etapa Bioprecision2 XY | Ludl Electronic Products | Etapa XY motorizada | |
| Cámara de incubación superior Okolab | Bold Line | Temperatura, CO2 y suministro de humedad | |
| Cultivo celular | |||
| Células de cáncer de cuello uterino | HeLa DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblastos | DSMZ | ACC-59 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco 31985070 | Medio sérico reducido | |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicilina/Estreptomicina (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Medio de crecimiento completo (DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% de PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfección reactivo |
| Ácido ascórbico (AA) | Sigma | A544-25G | |
| placa de cultivo celular de 6 pocillos | Sarstedt | 83.392 | |
| Platos con fondo de vidrio | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35 mm, cubreobjetos de vidrio de 0,17 mm |
| Fibronectina, plasma bovino | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Cámara mejorada de Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Perlas TetraSpeck | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmidios | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Instituto de Microbiología Médica, Centro Médico Universitario de Hamburgo Eppendorf, Alemania | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Instituto de Microbiología Médica, Centro Médico Universitario de Hamburgo Eppendorf, Alemania | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Versión 3 | |
| ImageJ | Versión 1.52c | ||
| Complemento | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | esta publicación | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | versión 6.2.2 |
Referencias
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
- Gustafsson, M. G. L.
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Reimpresiones y permisos
