Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

Nuestros días, técnicas de microscopía de luz proporciona la proyección de imagen estupendo de alta resolución en fijo y vida ejemplar están desarrollando rápidamente. Técnicas de súper-resolución como estimularon emisión microscopía de iluminación de agotamiento (STED), estructurado (SIM) y microscopía de localización de foto activación (PALM) o microscopía directa reconstrucción óptica estocástica (tormenta), respectivamente, son disponible en el mercado y permiten la proyección de imagen de estructuras subcelulares que muestra detalles casi en la escala molecular^1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques todavía han limitado aplicabilidad para los experimentos de imagen vivo en que grandes volúmenes deben visualizarse con varios fotogramas por segundo la velocidad de adquisición. Variedades de procesos altamente dinámicos regulados a través de la membrana plasmática, por ejemplo, endo- / exocitosis, adherencia, migración o señalización, se producen con alta velocidad dentro de grandes volúmenes celulares. Recientemente, con el fin de llenar este vacío, una técnica de microscopía integrado fue propuesto llamado spinning disco-TIRF (SD-TIRF)⁷. En detalle, microscopía TIRF permite específicamente aislar y localizar la membrana del plasma^8,9, mientras que la microscopia SD es uno de los más sensibles y rápidas en vivo las técnicas de imagen para la visualización y seguimiento de orgánulos subcelulares en el citoplasma^10,11. La combinación de ambas técnicas de imagen en una sola configuración ya se ha realizado en los últimos^12,13, sin embargo, el microscopio (Figura 1) presentan finalmente cumple con los criterios para realizar experimentos de SD-TIRF imagen vivo de dichos procesos a 3 fotogramas por segundo la velocidad. Puesto que este microscopio está comercialmente disponible, el objetivo de este manuscrito debe describir en detalle y proporcionar herramientas de código abierto y protocolos de adquisición de imágenes, registro y visualización asociadas con microscopía TIRF de SD.

La configuración se basa en un microscopio invertido conectado a unidades de exploración de dos vía puertos independientes - el puerto izquierdo está vinculado a la unidad de la SD y el puerto posterior a la unidad de escáner para TIRF y foto activación/blanqueamiento experimentos. Hasta 6 láseres (405/445/488/515/561/640 nm) puede ser utilizado para la excitación. De excitación y detección de la señal de fluorescencia, ya sea un 100 x / NA1.45 de aceite o 60 x / NA1.49 aceite objetivo TIRF, respectivamente, han sido empleados. La luz emitida es dividida por un espejo dicroico (561 nm largo-pase o 514 nm largo-) y filtrada por diversos filtros band-pass (55 nm amplia centrada en 525 nm, 54 nm amplia centrada en 609 nm para fluorescencia verde y roja, respectivamente) colocado delante de la cam EM-CCD dos eras. Tenga en cuenta que más técnica acerca de la configuración se detalla en Zobiak et al. ⁷. en la configuración de la TIRF, la unidad de la SD se mueve fuera de la trayectoria de la luz dentro de alrededor de 0.5 s para que el mismo dos cámaras pueden utilizarse para la detección, lo que permite una conmutación más rápida entre las dos modalidades de proyección de imagen en comparación con alrededor de 1 s que fue divulgado en el pasado^{13 < /C2 >. Esta característica permite la adquisición simultánea de dos canales, 4 canales SD-TIRF imágenes en previamente incomparable velocidad y precisión se puede realizar. Por otra parte, la alineación entre imágenes SD y TIRF es innecesaria. Alineación de la imagen entre las dos cámaras, sin embargo, tiene que ser revisado antes de iniciar el experimento y corregida si es necesario. En el siguiente protocolo, se implementó una rutina de corrección de registro en una macro ImageJ uno mismo-escrita. Por otra parte, la macro principalmente fue diseñada para permitir una visualización simultánea de conjuntos de datos TIRF a pesar de su diferente dimensionalidad y SD. El software de adquisición no presentó estas características.}

1. preparación de las células

1. Dos días antes del experimento, la semilla 3 * 10⁵ HeLa o NIH3T3 células en 2 mL de medio de cultivo completo por pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos. Asegúrese de que las células se manejan en una campana de flujo laminar a lo largo de este protocolo.
2. Un día antes del experimento, preparar los reactivos de transfección según las recomendaciones del fabricante o un protocolo determinado empíricamente, por ejemplo:
   1. Diluir 1 μg de RFP-Lifeact y 1 μg de YFP-vinculina en un total de 200 μL de medio de suero reducido. Vórtice el reactivo de transfección brevemente, añadir 4 μL a 200 μL ADN y agitar de nuevo. Incubar la mezcla de transfección para 15-20 min a temperatura ambiente.
   2. Añadir gota a gota la mezcla de transfección todo directamente a las células. Mezclar por agitación de la placa y colocarla en la incubadora.
3. En el día del experimento, preparar la muestra para la proyección de imagen en:
   1. Preparar un 10 μg/mL de solución de fibronectina en PBS para recubrir la superficie de un plato de fondo de cristal de 35 mm. Utilice sólo alta calidad 0,17 mm vidrio cubreobjetos para rendimiento óptimo de la TIRF y evitar platos de plástico inferior. Deje la solución sobre la superficie de vidrio de 30 min a temperatura ambiente, luego retírelo y deje que el plato deje secar al aire.
   2. Diluir una solución de granos múltiples fluorescente de 0.1 μm a una densidad de 1.8 x 10⁹ partículas por mL de agua destilada y añadir la solución de 30-60 s a la superficie de vidrio recubierto de fibronectina. Retire inmediatamente la solución y deje que el plato deje secar al aire.
      Nota: Este paso es necesario sólo si el plano de la TIRF debe encontrarse antes de sembrar las células o para adquirir una imagen de referencia de 2 colores de registro basado en el grano de la imagen.
   3. Preparar una solución de ácido ascórbico (AA) de 0,1 M y diluir hasta una concentración final de 0,1 mM de crecimiento medio (AA-). Coloque la solución en un baño de agua de 37 ° C.
      Nota: Utilice fluorescencia optimizada medio de cultivo celular si es posible, tales como libre de phenolred y medio flavin reducido (ribo-). AA es un agente antioxidante que puede reducir los efectos phototoxic durante proyección de imagen en¹⁴. Nosotros hemos probado con éxito en este ensayo, es decir, más células aparecieron sanas bajo las condiciones aplicadas que sin adición de AA. Sin embargo, el pH del medio fue bajado por 0,17 unidades de pH.
   4. Lavar las células con 2 mL de PBS, Añadir 250 μl tripsina-EDTA y espere hasta que las células son completamente independiente (2-3 minutos en una incubadora de 37 ° C). Resuspender las células cuidadosamente 1 mL pre calentado medio de AA con una pipeta y se agrega a 4 mL de medio de AA en un tubo de cultivo de célula de 15 mL. Coloque la suspensión celular con una tapa un poco abierta en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ en las cercanías del microscopio.
   5. Añadir 1 mL previamente calentado medio de AA en el plato de fondo de vidrio y colóquelo en el soporte del microscopio precalentado (ver párrafo siguiente).

2. en proyección de imagen

1. Iniciar el control ambiental del microscopio para lograr un estable 37 ° C, 5% CO₂ y atmósfera húmeda.
   Nota: Aquí, una cámara de incubación superior pequeño escenario se ha utilizado que permite configuración estable dentro de unos 15 minutos más grandes incubadoras necesitarán más tiempo para alcanzar condiciones estables.
2. Fijar todos los parámetros de adquisición en el microscopio antes de aplica la suspensión de células:
   1. Establecer el intervalo de tiempo de 30 s y la duración a 60-90 min activan la función de enfoque automático de lo basados en hardware-enfoque automático para cada punto del tiempo (valor "1").
   2. Ajuste la exposición de la cámara y ganancia, así como la potencia del láser para cada canal. Alta ganancia niveles, tiempo de exposición bajo y láser de baja potencia son recomendables para reducir la toxicidad de la foto.
      Nota: Los datos presentados aquí fue adquiridos con la exposición de 200 ms, aumento de energía del laser nivel 500 y el 20% que equivale a intensidades de excitación de 0,5 W/cm² de 488 nm y 1 W/cm² para 561 nm, respectivamente.
   3. Coloque la pila de z para los canales discos 10 μm con 0,4 μm espaciado. Desactivar z-pilas para los canales TIRF. Configure el desplazamiento inferior a «0», es decir, el plano más bajo será la posición de enfoque de hardware auto-focus.
   4. Activar la función de múltiples puntos "posiciones de la etapa".
      Nota: Hasta 3 posiciones pueden grabarse en un intervalo de tiempo de 30 s.
3. Encontrar los granos fluorescentes iluminación epi-fluorescente en el ocular o en la pantalla del ordenador, luego activar un canal de la TIRF y fijar el ángulo de iluminación a un valor que indica iluminación TIRF. Activar el enfoque automático al presionar el botón en el panel de microscopio y ajustar el enfoque con la rueda de desplazamiento. Adquirir un conjunto de datos 2-color, es decir TIRF-488 y TIRF-561, para el registro posterior de imagen basados en grano (ver punto 3.1).
   1. Opcional: Para garantizar la iluminación de la TIRF, añadir unos pocos microlitros de la suspensión de perlas multicolor fluorescente libremente flotante (ver punto 1.3.2.). Activar la vista en vivo de un canal de la TIRF y aumentar el ángulo de iluminación. Los granos no adherente desaparecerá más allá del ángulo crítico, asegurando un correcto TIRF iluminación⁸.
4. Mezcle la suspensión de células otra vez invirtiendo el tubo cerrado 2 - 3 veces y aplicar 1 mL de las células en el plato de imagen.
5. Encontrar rápidamente las células transfected doble con iluminación epi-fluorescente nivel baja. Centro de las células en la previsualización de cámara en vivo con iluminación de campo claro y marcar la posición. Encontrar otros 1-2 puntos de interés y guardarlos en la lista de posiciones.
   Nota: Al principio, las células fácilmente pueden separar debido al movimiento de la etapa, por lo tanto, establecer posiciones 4-5 y vuelva a comprobar todo antes de comenzar la adquisición de la imagen. Luego, descartar posiciones 1-2.
6. Iniciar la adquisición de datos haciendo clic en el botón de "Secuencia".

3. procesamiento posterior imagen en ImageJ

1. Con el fin de generar un hyperstack sin registro en FIJI¹⁵, una macro llamada "SD-TIRF_helper" se ha escrito que se puede aplicar a conjuntos de datos de 2-4 canales SD-TIRF timelapse. Guarde el archivo "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" en el FIJI "macros" de la carpeta y ejecute la macro haciendo clic en el comando de menú "Plugins > Macros > Ejecutar...".
   1. Si los canales de color necesitan corrección de inscripción, seleccione la opción crear una nueva referencia de registro basado en el grano (archivo histórico) y usar un archivo existente que se creó antes.
      Nota: El plugin turboreg del¹⁶ se aplicará a imágenes de referencia de perlas de fluorescencia. Instalar el plugin en el software de FIJI según las directrices generales para la instalación del plugin.
   2. Importar los datos con el importador de bio-formatos y elija hyperstack como una opción de visualización. Cargar el dataset de la imagen, seleccione la serie de SD en el primer paso y la TIRF-serie en el segundo paso. FIJI mostrará los datos ordenados por canal y etapa de posición, es decir, normalmente los canales SD y TIRF todos los canales se muestran como un hyperstack para cada posición que se ha seleccionado.
      Nota: La importación de datos es posible desde varios tipos de archivos, por ejemplo TIFF-serie o archivo dependiente de la plataforma tipos tales como * .nd. El tipo de archivo no puede ser reconocido solamente si no se exporta por el software de adquisición como independiente, sin compresión formato TIFF.
   3. La corrección del registro se aplican a los respectivos canales por cargar el archivo de puntos de referencia predeterminados.
   4. Seleccione la tabla de búsqueda del color deseado (LUT) para cada canal SD y TIRF y combinarlos en un hyperstack único y multidimensional.
      Nota: Durante el procesamiento de los canales de la TIRF, un número de planos de z con cero valores de intensidad se añade en la parte superior del plano inferior que coincide con el número de aviones de z en el conjunto de datos de la SD. Este paso es importante para la visualización de la hyperstack final. Esta metodología es correcta, desde la profundidad de la iluminación de la TIRF (menos de 200nm⁷) es más pequeño que el tamaño de paso z de la pila de SD (400 nm).

Para demostrar el potencial de la proyección de imagen de SD-TIRF, que un ensayo fue desarrollado debe revelar la organización espacio-temporal de complejos de adhesión célula-matriz y su interacción con el citoesqueleto durante la adhesión celular. Por lo tanto, adherente HeLa o, alternativamente, NIH3T3 células fueron transfectadas con YFP-vinculina y RFP-Lifeact de 18-24 h, tripsinizaron y semillas en platos de fondo de vidrio recubierto de fibronectina. Estas líneas celulares fueron elegidas por su citoesqueleto pronunciado y mayor robustez en vivo imagen experimentos frente a, por ejemplo, células primarias. No los podrían soportar la proyección de imagen en condiciones muy delicadas como son tras tratamiento con tripsina. En el microscopio, células de YFP/RFP-expresión fueron seleccionadas y el proceso de adhesión observado durante un 60 minutos Time-lapse (películas 1 y 2 yfigura 2 ). Este ensayo específico raramente y no claramente descrito en la literatura17,18. Por otra parte, la formación de adherencias sobre todo ha sido investigada en por ejemplo, migración de células19,20. Por lo tanto, teníamos que adaptar esta metodología (línea celular, capa, medio, composición) para llevar a cabo los experimentos descritos en este documento.

Como era de esperar, las células eran forma redonda al principio y sólo débilmente adherente, mientras que protrusiones de membrana fueron detección del medio ambiente y hacer contacto con el sustrato. Contactos célula-matriz consolidaron rápidamente a la formación de adherencias naciente llamada20,21 (figura 2A, TIRF-488 canal, tiempo puntos 0-4.5 min). Estos últimos son positivo de la vinculina, punto-como las estructuras en el lado ventral de la célula. Las estructuras eran claramente visibles en las imágenes TIRF. En el inicio de la formación de adherencias, actinia se distribuye uniformemente en la celda y no localizar a estos principios complejos (figura 2A, canal SD-561). En el transcurso del tiempo, complejos de adhesión ampliado y maduraron a adherencias focales (figura 2). Estas estructuras alargadas eran predominante evidentes en la periferia de la célula (Figuras 2A + B) y resultaron de fuerzas que se ejercen por las fibras de acto-miosina. Estas fibras se comenzaron a conectar a los complejos de adhesión, así tirando de ellos hacia el centro de la célula e inducir el fortalecimiento de las adherencias célula-matriz, así como la agrupación de las fibras de actina21. Al parecer, la célula también aplanado como resultado de la formación de redes de actina (figura 2A, vista XZ). SD-proyección de imagen de prueba para el método de elección, ya que permite visualizar este proceso desde una perspectiva completa y con alta sensibilidad, resolución espacial. En un informe anterior17, TIRF solo sólo podría dejar especular sobre el origen de las adherencias periféricas, mientras que la proyección de imagen de SD-TIRF reveló claramente su asociación con filopodios (figura 2B, momento 17 min, punta de flecha blanca). De hecho, las fibras de actina emergente, centripetally, de adherencias focales llegó a ser visibles después de 27 minutos (figura 2B, flecha amarilla).

Sin embargo, la configuración de la adquisición de estos experimentos, es decir, la velocidad, excitación aumento de intensidad y detector, deben evaluarse cuidadosamente. El intervalo de 30 s/punto, permitiendo múltiples punto de adquisición, parece ideal, mientras que la intensidad de la radiación del láser de excitación (entre 0.5-1 W/cm²) debe ser tomado bajo consideración crítica. Figura 2D muestra una célula en una posición diferente en el mismo experimento que no se pudo adjuntar al sustrato. Es posible que efectos phototoxic afectaron el biología de la célula, que finalmente dio lugar a la membrana burbujeo después de alrededor de 60 min, probablemente parecido a apoptosis (película 2). Esto claro otra vez células sensibles cómo puede reaccionar a la fototoxicidad y que es importante encontrar en que un buen equilibrio entre la cantidad de luz pone y la información están tomando hacia fuera. Reducción de la potencia del láser, el número de imágenes en una pila de z o el aumento de la ganancia puede ser la correcta estrategia para la reducción de fototoxicidad. Todos estos ajustes, sin embargo, deben ajustarse a un nivel que permite alcanzar la suficiente resolución y relación señal a ruido, que permiten extraer información cuantitativa desde el lapso de tiempo registrado.

Figura 1: esquema de la configuración de SD-TIRF. A. modo de proyección de imagen de SD: 6 líneas de láser diferentes (líneas 405/445/488/515/561/640nm, verde) se juntan en la unidad de exploración confocal (CSU), pasando por la SD (posición 'IN') y un cubo de filtro vacío en el cuerpo del microscopio (MIC). Emisión de fluorescencia de la muestra (espec.) se proyecta a través de los agujeros de la SD y dividida por diferentes espejos dicroicos, por ejemplo, de verde y rojo o amarillo/cyan adquisición simultánea, en dos diferentes cámaras EM-CCD (C1 y C2). Filtros de fluorescencia se colocan delante de las camaras (no mostradas). B. modo proyección de imagen de TIRF: las líneas láser se juntan en el escáner TIRF (TIRF). Un divisor de haz de líneas múltiples en el MIC dirige el rayo a la muestra y la emisión de luz puentea la SD ('OUT') para la transmisión máxima. La fluorescencia se detecta por las mismas cámaras y filtros de emisión se describe en A. Esta figura ha sido modificada de Zobiak et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: resultados representativos de formación difusión y adhesión de la célula mediante microscopía TIRF de SD. A. célula HeLa transfectadas doble expresando RFP-Lifeact (canal rojo, SD-561) y YFP-vinculina (canal verde, TIRF-488) fueron cubreobjetos de vidrio tripsinizaron y resembraron en revestimiento de fibronectina. Formación de adherencias se convierte fácilmente visible, a partir de pequeñas adherencias nacientes (puntos positivo de vinculina) a 0 los minutos que se convierten en grandes adherencias focales después de alrededor de 5 minutos. Actina cortical es aparente después de alrededor de 10 minutos y se extiende en la periferia de las células (véase marcos a los minutos 12 y 24.5). B. la vista ampliada de la región en caja (marco en 45 minutos) muestra que se separa de la célula y la transición de adherencias nacientes a focal así como adherencias asociadas de filopodios (flecha blanca) y formación de la fibra de estrés (véase el cuadro a los 27 minutos, amarillo punta de flecha). C. Kymograph de la línea amarilla discontinua en a. D. (Foto-) Efectos tóxicos sobre células o malsana de lo contrario les pueden dejar dejar de fijar al sustrato. Condiciones de proyección de imagen tienen que ser evaluados críticamente para excluir fototoxicidad. Barra de escala = 5 μm (en la A y D) y 2 μm (B y C). Las vistas XZ en A y D son las proyecciones ortogonales extraídas de las líneas blancas punteadas dibujadas en ella (parte inferior = sustrato). Las imágenes eran linealmente contraste y filtrado de mediana con un kernel de 3 x 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: la reconstrucción 3D de la secuencia de lapso de tiempo en la figura 2A. La secuencia de imágenes fue rendida con 3D software de imágenes. Duración: tasa de adquisición de 42,5 min.: 2 pilas de SD-TIRF de doble canal por minuto (56 capítulos en total) fueron adquiridas. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

2 de la película: película de la secuencia de lapso de tiempo en la figura 2 C. Duración: tasa de adquisición 60 min: 2 pilas de SD-TIRF de doble canal por minuto (56 capítulos en total) fueron adquiridas. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Los autores no tienen nada que revelar.