Artículo de método

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 de enero de 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

En este artículo

Resumen

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Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

Resumen

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En las células vivas, procesos como la formación de adherencias implican grandes cambios estructurales en la membrana plasmática y el interior de la célula. Para poder visualizar estos eventos altamente dinámicos, se combinaron dos técnicas de microscopía de luz complementarias que permiten la proyección de imagen rápida de muestras vivo: girar a microscopía de disco (SD) para el registro del volumen rápido y de alta resolución y reflexión interna total Microscopía de fluorescencia (TIRF) para localización precisa y la visualización de la membrana plasmática. Aparecerá un protocolo de imagen integral y completado para guiar a través de la preparación de la muestra, calibración de microscopios, formación de la imagen y adquisición, dando por resultado varios color SD-TIRF de serie con alta resolución espacio-temporal. Todos pasos post procesado de imagen necesario para generar multidimensional vivo de conjuntos de datos, es decir, registro y combinación de los canales individuales, se proporcionan en una macro por escrito para el software de código abierto ImageJ. La proyección de imagen de proteínas fluorescentes durante la iniciación y maduración de los complejos de adhesión, así como la formación de la red del citoesqueleto de actina, fue utilizado como una prueba del principio de este nuevo enfoque. La combinación de microscopia de alta resolución 3D y TIRF proporciona una descripción detallada de estos procesos complejos en el entorno celular y, al mismo tiempo, localización precisa de las moléculas asociadas a membrana detectada con una alta relación de señal a fondo.

Introducción

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Nuestros días, técnicas de microscopía de luz proporciona la proyección de imagen estupendo de alta resolución en fijo y vida ejemplar están desarrollando rápidamente. Técnicas de súper-resolución como estimularon emisión microscopía de iluminación de agotamiento (STED), estructurado (SIM) y microscopía de localización de foto activación (PALM) o microscopía directa reconstrucción óptica estocástica (tormenta), respectivamente, son disponible en el mercado y permiten la proyección de imagen de estructuras subcelulares que muestra detalles casi en la escala molecular1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques todavía han limitado aplicabilidad para los experimentos de imagen vivo en que grandes volúmenes deben visualizarse con varios fotogramas por segundo la velocidad de adquisición. Variedades de procesos altamente dinámicos regulados a través de la membrana plasmática, por ejemplo, endo- / exocitosis, adherencia, migración o señalización, se producen con alta velocidad dentro de grandes volúmenes celulares. Recientemente, con el fin de llenar este vacío, una técnica de microscopía integrado fue propuesto llamado spinning disco-TIRF (SD-TIRF)7. En detalle, microscopía TIRF permite específicamente aislar y localizar la membrana del plasma8,9, mientras que la microscopia SD es uno de los más sensibles y rápidas en vivo las técnicas de imagen para la visualización y seguimiento de orgánulos subcelulares en el citoplasma10,11. La combinación de ambas técnicas de imagen en una sola configuración ya se ha realizado en los últimos12,13, sin embargo, el microscopio (Figura 1) presentan finalmente cumple con los criterios para realizar experimentos de SD-TIRF imagen vivo de dichos procesos a 3 fotogramas por segundo la velocidad. Puesto que este microscopio está comercialmente disponible, el objetivo de este manuscrito debe describir en detalle y proporcionar herramientas de código abierto y protocolos de adquisición de imágenes, registro y visualización asociadas con microscopía TIRF de SD.

La configuración se basa en un microscopio invertido conectado a unidades de exploración de dos vía puertos independientes - el puerto izquierdo está vinculado a la unidad de la SD y el puerto posterior a la unidad de escáner para TIRF y foto activación/blanqueamiento experimentos. Hasta 6 láseres (405/445/488/515/561/640 nm) puede ser utilizado para la excitación. De excitación y detección de la señal de fluorescencia, ya sea un 100 x / NA1.45 de aceite o 60 x / NA1.49 aceite objetivo TIRF, respectivamente, han sido empleados. La luz emitida es dividida por un espejo dicroico (561 nm largo-pase o 514 nm largo-) y filtrada por diversos filtros band-pass (55 nm amplia centrada en 525 nm, 54 nm amplia centrada en 609 nm para fluorescencia verde y roja, respectivamente) colocado delante de la cam EM-CCD dos eras. Tenga en cuenta que más técnica acerca de la configuración se detalla en Zobiak et al. 7. en la configuración de la TIRF, la unidad de la SD se mueve fuera de la trayectoria de la luz dentro de alrededor de 0.5 s para que el mismo dos cámaras pueden utilizarse para la detección, lo que permite una conmutación más rápida entre las dos modalidades de proyección de imagen en comparación con alrededor de 1 s que fue divulgado en el pasado13 < /C2 >. Esta característica permite la adquisición simultánea de dos canales, 4 canales SD-TIRF imágenes en previamente incomparable velocidad y precisión se puede realizar. Por otra parte, la alineación entre imágenes SD y TIRF es innecesaria. Alineación de la imagen entre las dos cámaras, sin embargo, tiene que ser revisado antes de iniciar el experimento y corregida si es necesario. En el siguiente protocolo, se implementó una rutina de corrección de registro en una macro ImageJ uno mismo-escrita. Por otra parte, la macro principalmente fue diseñada para permitir una visualización simultánea de conjuntos de datos TIRF a pesar de su diferente dimensionalidad y SD. El software de adquisición no presentó estas características.

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Protocolo

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1. preparación de las células

  1. Dos días antes del experimento, la semilla 3 * 105 HeLa o NIH3T3 células en 2 mL de medio de cultivo completo por pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos. Asegúrese de que las células se manejan en una campana de flujo laminar a lo largo de este protocolo.
  2. Un día antes del experimento, preparar los reactivos de transfección según las recomendaciones del fabricante o un protocolo determinado empíricamente, por ejemplo:
    1. Diluir 1 μg de RFP-Lifeact y 1 μg de YFP-vinculina en un total de 200 μL de medio de suero reducido. Vórtice el reactivo de transfección brevemente, añadir 4 μL a 200 μL ADN y agitar de nuevo. Incubar la mezcla de transfección para 15-20 min a temperatura ambiente.
    2. Añadir gota a gota la mezcla de transfección todo directamente a las células. Mezclar por agitación de la placa y colocarla en la incubadora.
  3. En el día del experimento, preparar la muestra para la proyección de imagen en:
    1. Preparar un 10 μg/mL de solución de fibronectina en PBS para recubrir la superficie de un plato de fondo de cristal de 35 mm. Utilice sólo alta calidad 0,17 mm vidrio cubreobjetos para rendimiento óptimo de la TIRF y evitar platos de plástico inferior. Deje la solución sobre la superficie de vidrio de 30 min a temperatura ambiente, luego retírelo y deje que el plato deje secar al aire.
    2. Diluir una solución de granos múltiples fluorescente de 0.1 μm a una densidad de 1.8 x 109 partículas por mL de agua destilada y añadir la solución de 30-60 s a la superficie de vidrio recubierto de fibronectina. Retire inmediatamente la solución y deje que el plato deje secar al aire.
      Nota: Este paso es necesario sólo si el plano de la TIRF debe encontrarse antes de sembrar las células o para adquirir una imagen de referencia de 2 colores de registro basado en el grano de la imagen.
    3. Preparar una solución de ácido ascórbico (AA) de 0,1 M y diluir hasta una concentración final de 0,1 mM de crecimiento medio (AA-). Coloque la solución en un baño de agua de 37 ° C.
      Nota: Utilice fluorescencia optimizada medio de cultivo celular si es posible, tales como libre de phenolred y medio flavin reducido (ribo-). AA es un agente antioxidante que puede reducir los efectos phototoxic durante proyección de imagen en14. Nosotros hemos probado con éxito en este ensayo, es decir, más células aparecieron sanas bajo las condiciones aplicadas que sin adición de AA. Sin embargo, el pH del medio fue bajado por 0,17 unidades de pH.
    4. Lavar las células con 2 mL de PBS, Añadir 250 μl tripsina-EDTA y espere hasta que las células son completamente independiente (2-3 minutos en una incubadora de 37 ° C). Resuspender las células cuidadosamente 1 mL pre calentado medio de AA con una pipeta y se agrega a 4 mL de medio de AA en un tubo de cultivo de célula de 15 mL. Coloque la suspensión celular con una tapa un poco abierta en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 en las cercanías del microscopio.
    5. Añadir 1 mL previamente calentado medio de AA en el plato de fondo de vidrio y colóquelo en el soporte del microscopio precalentado (ver párrafo siguiente).

2. en proyección de imagen

  1. Iniciar el control ambiental del microscopio para lograr un estable 37 ° C, 5% CO2 y atmósfera húmeda.
    Nota: Aquí, una cámara de incubación superior pequeño escenario se ha utilizado que permite configuración estable dentro de unos 15 minutos más grandes incubadoras necesitarán más tiempo para alcanzar condiciones estables.
  2. Fijar todos los parámetros de adquisición en el microscopio antes de aplica la suspensión de células:
    1. Establecer el intervalo de tiempo de 30 s y la duración a 60-90 min activan la función de enfoque automático de lo basados en hardware-enfoque automático para cada punto del tiempo (valor "1").
    2. Ajuste la exposición de la cámara y ganancia, así como la potencia del láser para cada canal. Alta ganancia niveles, tiempo de exposición bajo y láser de baja potencia son recomendables para reducir la toxicidad de la foto.
      Nota: Los datos presentados aquí fue adquiridos con la exposición de 200 ms, aumento de energía del laser nivel 500 y el 20% que equivale a intensidades de excitación de 0,5 W/cm² de 488 nm y 1 W/cm² para 561 nm, respectivamente.
    3. Coloque la pila de z para los canales discos 10 μm con 0,4 μm espaciado. Desactivar z-pilas para los canales TIRF. Configure el desplazamiento inferior a «0», es decir, el plano más bajo será la posición de enfoque de hardware auto-focus.
    4. Activar la función de múltiples puntos "posiciones de la etapa".
      Nota: Hasta 3 posiciones pueden grabarse en un intervalo de tiempo de 30 s.
  3. Encontrar los granos fluorescentes iluminación epi-fluorescente en el ocular o en la pantalla del ordenador, luego activar un canal de la TIRF y fijar el ángulo de iluminación a un valor que indica iluminación TIRF. Activar el enfoque automático al presionar el botón en el panel de microscopio y ajustar el enfoque con la rueda de desplazamiento. Adquirir un conjunto de datos 2-color, es decir TIRF-488 y TIRF-561, para el registro posterior de imagen basados en grano (ver punto 3.1).
    1. Opcional: Para garantizar la iluminación de la TIRF, añadir unos pocos microlitros de la suspensión de perlas multicolor fluorescente libremente flotante (ver punto 1.3.2.). Activar la vista en vivo de un canal de la TIRF y aumentar el ángulo de iluminación. Los granos no adherente desaparecerá más allá del ángulo crítico, asegurando un correcto TIRF iluminación8.
  4. Mezcle la suspensión de células otra vez invirtiendo el tubo cerrado 2 - 3 veces y aplicar 1 mL de las células en el plato de imagen.
  5. Encontrar rápidamente las células transfected doble con iluminación epi-fluorescente nivel baja. Centro de las células en la previsualización de cámara en vivo con iluminación de campo claro y marcar la posición. Encontrar otros 1-2 puntos de interés y guardarlos en la lista de posiciones.
    Nota: Al principio, las células fácilmente pueden separar debido al movimiento de la etapa, por lo tanto, establecer posiciones 4-5 y vuelva a comprobar todo antes de comenzar la adquisición de la imagen. Luego, descartar posiciones 1-2.
  6. Iniciar la adquisición de datos haciendo clic en el botón de "Secuencia".

3. procesamiento posterior imagen en ImageJ

  1. Con el fin de generar un hyperstack sin registro en FIJI15, una macro llamada "SD-TIRF_helper" se ha escrito que se puede aplicar a conjuntos de datos de 2-4 canales SD-TIRF timelapse. Guarde el archivo "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" en el FIJI "macros" de la carpeta y ejecute la macro haciendo clic en el comando de menú "Plugins > Macros > Ejecutar...".
    1. Si los canales de color necesitan corrección de inscripción, seleccione la opción crear una nueva referencia de registro basado en el grano (archivo histórico) y usar un archivo existente que se creó antes.
      Nota: El plugin turboreg del16 se aplicará a imágenes de referencia de perlas de fluorescencia. Instalar el plugin en el software de FIJI según las directrices generales para la instalación del plugin.
    2. Importar los datos con el importador de bio-formatos y elija hyperstack como una opción de visualización. Cargar el dataset de la imagen, seleccione la serie de SD en el primer paso y la TIRF-serie en el segundo paso. FIJI mostrará los datos ordenados por canal y etapa de posición, es decir, normalmente los canales SD y TIRF todos los canales se muestran como un hyperstack para cada posición que se ha seleccionado.
      Nota: La importación de datos es posible desde varios tipos de archivos, por ejemplo TIFF-serie o archivo dependiente de la plataforma tipos tales como * .nd. El tipo de archivo no puede ser reconocido solamente si no se exporta por el software de adquisición como independiente, sin compresión formato TIFF.
    3. La corrección del registro se aplican a los respectivos canales por cargar el archivo de puntos de referencia predeterminados.
    4. Seleccione la tabla de búsqueda del color deseado (LUT) para cada canal SD y TIRF y combinarlos en un hyperstack único y multidimensional.
      Nota: Durante el procesamiento de los canales de la TIRF, un número de planos de z con cero valores de intensidad se añade en la parte superior del plano inferior que coincide con el número de aviones de z en el conjunto de datos de la SD. Este paso es importante para la visualización de la hyperstack final. Esta metodología es correcta, desde la profundidad de la iluminación de la TIRF (menos de 200nm7) es más pequeño que el tamaño de paso z de la pila de SD (400 nm).

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Resultados

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Para demostrar el potencial de la proyección de imagen de SD-TIRF, que un ensayo fue desarrollado debe revelar la organización espacio-temporal de complejos de adhesión célula-matriz y su interacción con el citoesqueleto durante la adhesión celular. Por lo tanto, adherente HeLa o, alternativamente, NIH3T3 células fueron transfectadas con YFP-vinculina y RFP-Lifeact de 18-24 h, tripsinizaron y semillas en platos de fondo de vidrio recubierto de fibronectina. Estas líneas celulares fueron e...

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Discusión

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En este trabajo se presentó la primera aplicación exitosa de la SD y TIRF microscopia en una configuración conveniente para llevar a cabo experimentos imágenes de células vivas, es decir, las tasas de adquisición alto como 2 pilas de imagen de SD-TIRF por minuto a 3 alturas diferentes posiciones, correspondientes a un total de 168 marcos (alrededor de 3 fotogramas por segundo), fueron adquiridas. Algunos microscopios TIRF SD que fueron describen12,13, pr...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos enormemente a la comunidad científica de la Universidad médica Center Hamburg-Eppendorf para apoyarnos con las muestras para evaluación. Es decir, agradecemos Sabine Windhorst células NIH3T3, Andrea Mordhorst de YFP-vinculina y Maren Rudolph de RFP-Lifeact.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio > < y accesorios SD-TIRF fuerte Visitron Systems Ti con sistema >de
enfoque perfectoNikonSoporte de microscopio invertido
CSU-W1 T2YokogawaUnidad de disco giratorio en configuración de doble cámara
Escáner Roper ScientificTIRF/FRAP
Evolve Cámaras PhotometrixEM-CCD
Etapa PiezoZ LudlElectronic ProductsEtapa Z motorizada
Etapa Bioprecision2 XYLudl Electronic ProductsEtapa XY motorizada
Cámara de incubación superior OkolabBold LineTemperatura, CO2 y suministro de humedad
Cultivo celular
Células de cáncer de cuello uterinoHeLa DSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastosDSMZACC-59
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)Gibco14190144
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco 31985070Medio sérico reducido
Suero fetal de ternera (FCS)Gibco10500064
Penicilina/Estreptomicina (PenStrep)Gibco15140148
Medio de crecimiento completo (DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% de PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfección reactivo
Ácido ascórbico (AA)SigmaA544-25G
placa de cultivo celular de 6 pocillosSarstedt83.392
Platos con fondo de vidrioMatTekP35G-1.5-10-C35 mm, cubreobjetos de vidrio de 0,17 mm
Fibronectina, plasma bovinoThermoFisher Scientific33010018
Cámara mejorada de NeubauerVWR631-0696
Perlas TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmidios
RFP-LifeactMaren Rudolph, Instituto de Microbiología Médica, Centro Médico Universitario de Hamburgo Eppendorf, Alemania
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Instituto de Microbiología Médica, Centro Médico Universitario de Hamburgo Eppendorf, Alemania
Software and plugins
VisiViewVisitron SystemsVersión 3
ImageJVersión 1.52c
Complementohttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"esta publicaciónhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerversión 6.2.2
iLAS2  Turboreg

Referencias

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