Análisis de SEM es un método eficaz para ayudar en la identificación de las especies o la discriminación fenotípica. Este protocolo describe los métodos para examinar los detalles morfológicos específicos de tres tipos representativos de organismos y sería ampliamente aplicable a examinar características de muchos organismos y tipos de tejidos.
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Artículo de método
Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)
En este artículo
Resumen
Resumen
Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una técnica ampliamente disponible que se ha aplicado para estudiar a especímenes biológicos que van desde proteínas individuales a las células, tejidos, organelos y organismos incluso todo. Este protocolo se centra en dos métodos de secado químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) y el alcohol t-butílico (TBA) y su aplicación a la proyección de imagen de organismos procarióticos y eucarióticos con SEM. En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El propósito de este protocolo es describir un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de las muestras que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para morfológico evaluación. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a otros utilizar SEM para visualizar muestras aplicando estas técnicas a su sistema.
Introducción
Un microscopio electrónico de barrido (MEB) utiliza un haz enfocado de electrones de alta energía para generar una imagen de electrones secundarios que muestra la morfología y la topografía de una muestra de1. SEM puede utilizarse para determinar directamente el tamaño físico de una muestra, la estructura superficial y la forma tridimensional y ofrece una mayor resolución y mayor profundidad de campo en comparación con microscopia ligera. Otra forma de microscopia electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza electrones enfocados que pasan a través de la muestra, generando imágenes con los detalles finos de la estructur....
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Protocolo
1. preparación y fijación
- Preparación de cianobacterias.
- Crecen cultivos axénicos en F/2 medios24,25 a una temperatura de 28 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferencia de cultura suficiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que después de permitir que 15 min resolver, el pellet bacteriano es aproximadamente 0,05 mL en tamaño. Quitar los medios de comunicación y reemplazar con 1,5 mL de fijador (glutaraldehído 1.25%, tampón de fosfato 0,1 M pH 7.0), suavemente invertir varias veces e incubar durante una noche a 4 ° C.
- La transferencia de las células fijas con una pipeta ....
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Resultados
Cianobacterias son un grupo de procariota de organismos que son críticos para el carbono, el oxígeno y el nitrógeno ciclos28,29. De las aproximadamente 6000 especies de cianobacterias30, más tienen una envoltura mucilaginosa que recorren y conectan las células entre sí y a otras estructuras31, que junto con la forma, puede ser resuelto microscópico32. Tamaño d.......
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Discusión
Aquí hemos descrito un protocolo de uso de SEM para obtener información detallada sobre las características morfológicas externas de los tres tipos de organismos que otros pueden aplicar para examinar características de muchos tipos de organismos o tejidos. Dentro de cada paso del Protocolo, hay posibles puntos de error que pueden surgir y se discuten en detalle más adelante.
Mientras que los volúmenes de fijador y lavado dado aquí son específicos, en general el fijador y lavado debe ser 5-10 .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención a la MLS y un verano Scholar Award a MAK de la oficina de investigación y estudios de posgrado en la Universidad de Michigan Central. Cianobacterias fueron suministradas por la Zimba y laboratorio de plancton, parte del centro para estudios costeros, Texas A & M University en Corpus Christi. Euglenoides fueron suministrados por el laboratorio Triemer, Universidad Estatal de Michigan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Oro – paladio | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Adhesivo conductor de plata 503 | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 12686-15 | |
| Membranas grabadas con trazas de nucleporos Whatman; diámetro 25 mm, tamaño de poro 8 μ m, policarbonato | Sigma | WHA110614 | |
| membranas grabadas con huellas de nucleporos Whatman; diámetro 25 mm, tamaño de poro 0,8 μ m, policarbonato, negro | Membranas grabadas | ||
| Whatman; 25 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,2 μ m, plato de pesaje de policarbonato | Sigma | WHA110606 | |
| aluminio | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| talones de montaje de aluminio (12 mm) | Electrónica Microscopy Sciences | 75210 | |
| talones de montaje de aluminio (25 mm) | Electrónica Microscopy Sciences | 75186 | |
| Lengüetas adhesivas | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 76760 | |
| lengüetas adhesivas de carbono conductor | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 77825 | |
| F/2 | medios Colección de cultivo de algas en la Universidad de Texas en Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Se proporciona el número de catálogo - ver enlace |
| AF6 media | Bigelow - Centro Nacional de Algas Marinas y Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Se proporciona el número de catálogo - ver enlace |
| Medio de agua del suelo | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Éter de terc-octilfenilo de polietilenglicol (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Recubrimiento por pulverización catódica | Anatech EE. UU | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Se proporciona el número de catálogo - ver enlace | |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE | La empresa ya no parece vender este modelo |
Referencias
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
- Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
- Egerton, R. F.
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Reimpresiones y permisos
