La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

Resumen

Estimulación de ultrasonido pulsado (LIPUS) de baja intensidad es una modalidad de estimulación mecánica no invasiva de células endógenas o ingeniería con alta resolución espacial y temporal. Este artículo describe cómo implementar LIPUS a un microscopio de epifluorescencia y cómo minimizar el desajuste de impedancia acústica en el camino de ultrasonido para evitar artefactos mecánicos no deseados.

Resumen

Al enfocar pulsos de ultrasonido de baja intensidad que penetran en los tejidos blandos, LIPUS representa una prometedora Tecnología biomédica remotamente y con seguridad manipular leña neuronal, secreción hormonal y las células reprogramadas genéticamente. Sin embargo, la traducción de esta tecnología para aplicaciones médicas actualmente es obstaculizada por la falta de mecanismos biofísicos que objetivo sentido tejidos y responder a LIPUS. Un enfoque adecuado para identificar estos mecanismos sería utilizar biosensores ópticos en combinación con LIPUS para determinar base de vías de señalización. Sin embargo, aplicación del LIPUS a un microscopio de fluorescencia puede introducir artefactos mecánicos indeseados debido a la presencia de interfaces físicas que reflejan, absorben y refractan las ondas acústicas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para incorporar LIPUS a microscopios de epifluorescencia vertical comercialmente disponibles y reducir al mínimo la influencia de interfaces físicas a lo largo de la trayectoria acústica. Se describe un procedimiento sencillo para operar un solo elemento transductor y para poner la zona focal del transductor en el punto focal objetivo. El uso de LIPUS se ilustra con un ejemplo de transitorios del calcio LIPUS-inducida en células de glioblastoma humano cultivadas medidas usando proyección de imagen del calcio.

Introducción

Muchas enfermedades requieren de algún tipo de intervención médica invasiva. Estos procedimientos son a menudo costosas, riesgosas, requieren periodos de recuperación y así añadir una carga a los sistemas de salud. Modalidades terapéuticas no invasivas tienen el potencial para ofrecer alternativas más seguras y más baratas a los procedimientos quirúrgicos convencionales. Sin embargo, actuales no invasivos como la farmacoterapia o transcraneal de la estimulación magnética a menudo están limitados por las compensaciones entre la penetración del tejido, resolución espaciotemporal y efectos no deseados fuera del objetivo. En este contexto, un ultrasonido focalizado consti....

Protocolo

1. cultivo de células de película de poliester transparente acústicamente

1. Un tamaño de orificio de 12 mm en la parte inferior de una placa de cultivo de 35 mm estándar utilizando un taladro de prensa vertical del taladro. El taladro se mueven lentamente y Protéjase los ojos. Retire las piezas de plástico en la parte inferior del plato con una hoja para crear una superficie lisa en el lado externo (figura 2).
2. Aplique una capa delgada de resina epóxica grado marino o pegamento en la superficie inferior externa del plato.
3. Coloque una capa de poliester (2,5 μm espesor) contra la superficie inferior externa del pl....

Resultados

Figura 5 es un ejemplo de experimento LIPUS multiplexado con proyección de imagen de calcio. Células de glioblastoma (A-172) se cultiva en EMPM recubierto de película de poliéster en medio de cultivo estándar (suplementado con 10% suero y 1% antibióticos) y se incubaron con el reportero fluorescente sensible al calcio Fluo-4 AM. Células fueron fotografiadas usando un lente de inmersión X 10 e iluminado con una fuente de luz blanca de LED y luz de la fluoresce.......

Discusión

Una ventaja principal de ultrasonido focalizado es su capacidad para proporcionar de forma no invasiva energía mecánica o térmica a muestras biológicas con la alta precisión espacio-temporal. Otras técnicas pretende estimular mecánicamente las células generalmente emplean sondas física invasiva (por ejemplo, meter celular) o requiere la interacción de rayos láser de alta energía con objetos extraños (por ejemplo, pinzas ópticas). Calefacción magnético puede calentar ubicaciones espaciales específicas de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
microscopio vertical con gran volumen de trabajo	Thorlabs	CERNA
microscopio vertical con gran volumen de trabajo	Scientifica	SliceScope
componentes optomecánicos	Thorlabs	n/a
hidrófono de aguja	ONDA Corporation	serie HNP/C/R/A/T + preamplificador
hidrófono de aguja	Precision Acústica	n/a
hidrófono de fibra óptica	ONDA Corporation		HFO
	Precision Acoustics	n/a
osciloscopio	Keysight Technology	DSOX2004A (4 canales 70MHz)
generador de funciones	Keysight Technology	33500B (20MHz monocanal)
Amplificador de potencia RF	Industrias de navegación electrónica (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
Amplificador de potencia RF	Electrónica & Innovación (E& I)
transductor de ultrasonido de inmersión	Olympus	transductores de inmersión transductor
ultrasonido de inmersión	Benthowave Instrument	Transductor HiFu BII-76 series
transductor de ultrasonido de inmersión	Precision Acoustics	Transductores piezocerámicos o HiFu transductor
ultrasonido de inmersión	Ultrasonic-S-lab	Transductores HiFu fabricados bajo pedido
Matrigel de alta densidad	Corning	VWR 80094-330
Película Mylar 2,5 micras	Chemplex	CAT.NO:107

AH/G Hidrófono de fibra óptica serie de de