Este protocolo está diseñado para evaluar la citotoxicidad de T-cell (T-cell de coche) redireccionada inmunoterapéutico contra células cancerosas estructuradas 3D (esferoides) en tiempo real.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunoterapia se ha convertido en un campo de creciente interés en la lucha contra el cáncer de otra manera intratable. Entre todos los métodos de inmunoterapia, receptor del antígeno quimérico (coche) redirigido las células de T obtenidas los resultados más espectaculares, en particular con leucemia linfoblástica aguda-B pediátrica (B-ALL). Métodos de validación clásica de células T auto confían en el uso de especificidad y ensayos de funcionalidad de las células de T automóvil contra las células de la blanco en suspensión y en modelos de xenoinjerto. Por desgracia, observaciones in vitro a menudo se desemparejan de resultados obtenidos en vivo y un montón de esfuerzo y animales podría salvarse mediante la adición de un paso: el uso de la cultura 3D. La producción de esferoides de potenciales células Diana que imitan la estructura 3D de las células tumorales cuando son engrafted en el modelo animal representa una alternativa ideal. Aquí, Divulgamos un método asequible, fiable y fácil de producir esferoides de una línea de células transduced de colon como una herramienta de validación para la terapia celular adoptiva (ejemplificada aquí por las células CD19 coche T). Este método es junto con un avanzado sistema de proyección de imagen vivo que puede seguir el crecimiento del esferoide, efectoras células de citotoxicidad y tumor apoptosis de las células.
Introducción
Transferencia celular adoptiva (ACT) representa el tratamiento de cáncer de próxima generación. Se basa en la inyección de células efectoras (células T o NK) en un paciente. Estas células pueden ser modificadas genéticamente con un receptor que se guía a su destino, el tumor y lo destruyen. Este enfoque fue demostrado recientemente para ser factible cuando un Receptor de antígeno quimérico (coche) dirigido contra el marcador de células B CD19 fue introducido en las células T del paciente para matar su cáncer1. En el caso del coche, que es un receptor artificial, el diseño consiste de fragmentos de anticuerpos específicos, el antígeno vinculante....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. generación de esferoides de línea celular de cáncer colorrectal
- Monocapas de células de lavado HCT 116 (transduced estable para expresar del racimo de la diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con el fosfato tampón salino (PBS, 5 mL de 25 cm2 o 10 mL para un frasco de 75 cm2 ). Añadir tripsina (0,5 mL de 25 cm2 o 1 mL para un frasco de 75 cm2 ) e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.
- Compruebe separación de células bajo un microscopio y neutralizar la enzima de disociación celular con medio completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como puede verse en la figura 1, es crucial para controlar mediante citometría de flujo, el nivel de expresión de CD19 en células T (figura 1A) y el nivel de CD19 en líneas celulares de tumor HCT116 (figura 1B). Figura 2 ejemplifica el resultado de un experimento típico del esferoide. El aparato de proyección de imagen automatizado toma fotografías en cuatro canales dife.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El uso de esferoides como una innovadora herramienta para validar el tratamiento futuro contra el cáncer se ha convertido en un campo de creciente interés en los últimos años. Esferoides representan un paso intermedio entre el clásico 2D análisis in vitro y en vivo. El método más sostiene una gran promesa en cuanto a su potencia en términos de tumor micro-ambiente imitando así como gene perfiles7. El protocolo presentado en esta publicación es una adaptación del Saheen et al
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación noruego bajo becas #244388, 254817 # y #284983; la sociedad de cáncer Noruega (#6829007); La región de salud de Noruega del sudeste bajo la subvención #17/00264-6 y #2016006.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | strong>Número de lote: RNBG7037 |
| 75 cm² matraces de área de crecimiento | VWR | 430639Número de lote: 2218002 | |
| 75 cm² matraces de área de crecimiento | VWR | 734-2705 | Número de lote: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Número de lote: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Número de lote: 1926384 |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10500064 | Número de lote: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Número de lote: 1904924A |
| Solución de Azul de Tripano, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Número de lote: 1886513 |
| Placa de 96 pocillos, fondo redondo | VWR | 734-1797 | Número de lote: 33117036 |
| Dynabeads Activador T humano CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D-X-VIVO | |
| 15 con gentamicina L-Gln, rojo fenol, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Número de lote: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Número de lote: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Número de lote: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Número de lote: 17A1025-122117 |
| Depósito de reactivos | VWR | 89094-672 | Número de lote: 89094-672 |
| Tubos de 15 mL VWR | 734-1867 | Número de lote: 19317044 | |
| antihumano CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Número de lote: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotina-SP (espaciador largo) AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra Anti-Ratón IgG | ImmunoResearch | 115-066-072 | Número de lote: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Estreptavidina-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Línea de Carcinoma Colorrectal | ATCC | CCL-247-Incucyte | |
| S3 | Essen Bioscience |
Referencias
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
