Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.

Resumen

Los telómeros se transcriben, dando lugar a telomeric repeat-con larga noncoding RNAs (TERRA), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la biología telomérica, incluyendo formación de heterocromatina y homeostasis de longitud telomérica. Recientes descubrimientos revelaron que las moléculas TERRA también interactúan con regiones cromosómicas internas para regular la expresión génica en las células madre embrionarias (ES) de ratón. En consonancia con esta evidencia, RNA fluorescencia en situ del hibridación (pescado de RNA) análisis han demostrado que sólo un subconjunto de TERRA transcripciones localización en los extremos del cromosoma. Una mejor comprensión de la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción. Aquí, describimos un método para marcar y visualizar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células cancerosas mediante el sistema MS2-GFP. Para ello, presentamos un protocolo para generar clones estables, utilizando la línea celular del cáncer de estómago humano AGS, con secuencias de MS2 integradas en una sola subteloméricas. Transcripción de TERRA de telomere tagged MS2 se traduce en la expresión de moléculas etiquetadas MS2 TERRA que se visualizan por microscopia de fluorescencia de células vivas sobre la expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (GFP-MS2). Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de las moléculas TERRA solo telómeros en células cancerosas, y puede ser aplicado a otras líneas celulares.

Introducción

La larga noncoding TERRA de ARN es transcrito desde la región subteloméricas de los cromosomas y su transcripción procede hacia los extremos del cromosoma, que termina dentro de la zona de repetición telomérica^1,2. Por esta razón, las transcripciones TERRA consisten en secuencias subtelomeric deriva en su extremo 5' y terminan con repeticiones teloméricas (UUAGGG en vertebrados)³. Importantes roles han sido propuestos para TERRA, incluyendo la formación de la heterocromatina en telómeros^4,5, ADN replicación⁶

Protocolo

1. Selección de Clones resistentes a la neomicina

1. Cultivar células AGS en medio F-12_K del jamón (Kaighn) suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) a 37 ° C y 5% CO₂. Transfectar las células en un 50-60% de confluencia con el sgRNA/Cas9 expresando el vector y el cassette de MS2 en un 1:10 cociente molar²¹.
   Nota: En un experimento paralelo, comprobar eficacia de transfección transferencia un vector de expresión de GFP (es decir, GFP Cas9 vector). Al menos debe alcanzar el 60-70% de eficiencia de transfección.<....

Resultados

Figura 1 representa un resumen de la estrategia experimental. Los principales pasos del protocolo y un calendario indicativo para la generación de clones de TERRA-MS2 en células AGS se muestran (figura 1A). En el día 1, múltiples pocillos de una placa bien 6 son transfectados con el cassette de MS2 y sgRNA/Cas9 expresando vectores (se muestra en la figura 1B

Discusión

En este artículo presentamos un método para generar clones de células de cáncer humano que contiene secuencias de MS2 integradas en subteloméricas 15q. Usando estos clones, las moléculas etiquetadas MS2 TERRA transcritas de subteloméricas 15q son detectadas por microscopía de fluorescencia por la expresión de una proteína de la fusión de GFP MS2. Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de TERRA expresado desde una sola células del telómero en la vida de²¹. En este protocol.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células AGS	-	-	Regalo de Christian Baron (Université de Montré al).
F12K Nut Mix 1X	GIBCO	21127022	Medio de cultivo para células AGS
L-Glutamina	CORNING	MT25005CI	Componente del medio de cultivo celular
Solución de penicilina y estreptomicina	CORNING	30-002-CI	Componente del medio de cultivo
celular Suero fetal bovino	Sigma Aldrich	F2442	Componente del medio de cultivo celular
DMEM 1X	GIBCO	21068028	medio de cultivo para célula fénix
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	utilizado en la transfección de células fénix
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
Dextrosa	Sigma Aldrich	D9434	utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS) y la precipitación de retrovirus
Na2HPO4	Sigma	Aldrich S3264	utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
SOLUCIÓN DE TRIPSINA EDTA 1X	CORNING	59430C	utilizado en la división de células
DPBS 1X	GIBCO	14190250	solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Componente del medio de congelación celular (80% FBB y 20% DMSO)
G-418 Disulfato	para medio	G4185	fármaco de selección para
Solución de gelatina Biorreactivo	Sigma	Aldrich G1393	contenido de placa de ADN de 96 pocillos y placa de congelación
Tris-base	Fisher BioReagents	10376743	componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
SDS	Sigma Aldrich	71729	Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
Proteinasa K	Thermo Fisher	AM2546	Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
ARNasa A	Thermo Fisher	12091021	Degradación del ARN durante la extracción de ADN
Agarosa	Sigma Aldrich	A5304	Preparación de gel de ADN
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Reactivo de tinción utilizado para detectar muestras de ADN y ARN en etanol de gel de agarosa
	Bioreactivos Fisher BP28184		precipitación de ADN
Acetato de sodio	Sigma Aldrich	71196	Utilizado para la precipitación de ADN a una concentración de 3M pH5.2
Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR	Promega	A9282	Extracción de fragmentos de PCR de gel de agarosa durante el cribado por PCR de clones positivos para neomicina
Trizol	AMBION	15596018	Disolvente orgánico utilizado para la extracción de ARN
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradación del ADN genómico a partir de ARN
La mezcla de dNTPs	Invitrogen	10297018	utilizada en reacciones RT y PCR
DTT	Invitrogen	707265ML	utilizada en reacciones RT
pirocarbonato de dietilo	Sigma Aldrich	D5758	utilizada para inactivar ARNasas en agua (dilución 1:1000)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	Inhibidor de RNasa
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparación de gel de ARN
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Sciences	15710	Preparación de gel de ARN desnaturalizante (1% de PFA en 1x MOPS)
Superscript III Transcriptasa inversa	Invitrogen	18080-093 Reacción de	retrotranscripción
ADN polimerasa Pfu (recombinante)	Thermo Scientific	EP0501	Reacción de PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR Reacción	qPCR	de PB 20.14
El adenovirus Cre-GFP	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	se utiliza para infectar clones de TERRA-MS2 con el fin de eliminar el gen neomycn
Butirato de sodio	Sigma Aldrich	B5887	utilizado para promover la producción de partículas de retrovirus en células fénix
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitación de partes de retrovirus
35µ-Fondo de vidrio	para platos Ibidi	81158	utilizado en análisis de imágenes de células vivas de clones de TERRA-MS2

de de BIOSYSTEMS