Artículo de método

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

DOI:

10.3791/58790

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17 de enero de 2019

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1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los telómeros se transcriben, dando lugar a telomeric repeat-con larga noncoding RNAs (TERRA), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la biología telomérica, incluyendo formación de heterocromatina y homeostasis de longitud telomérica. Recientes descubrimientos revelaron que las moléculas TERRA también interactúan con regiones cromosómicas internas para regular la expresión génica en las células madre embrionarias (ES) de ratón. En consonancia con esta evidencia, RNA fluorescencia en situ del hibridación (pescado de RNA) análisis han demostrado que sólo un subconjunto de TERRA transcripciones localización en los extremos del cromosoma. Una mejor comprensión de la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción. Aquí, describimos un método para marcar y visualizar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células cancerosas mediante el sistema MS2-GFP. Para ello, presentamos un protocolo para generar clones estables, utilizando la línea celular del cáncer de estómago humano AGS, con secuencias de MS2 integradas en una sola subteloméricas. Transcripción de TERRA de telomere tagged MS2 se traduce en la expresión de moléculas etiquetadas MS2 TERRA que se visualizan por microscopia de fluorescencia de células vivas sobre la expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (GFP-MS2). Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de las moléculas TERRA solo telómeros en células cancerosas, y puede ser aplicado a otras líneas celulares.

Introducción

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La larga noncoding TERRA de ARN es transcrito desde la región subteloméricas de los cromosomas y su transcripción procede hacia los extremos del cromosoma, que termina dentro de la zona de repetición telomérica1,2. Por esta razón, las transcripciones TERRA consisten en secuencias subtelomeric deriva en su extremo 5' y terminan con repeticiones teloméricas (UUAGGG en vertebrados)3. Importantes roles han sido propuestos para TERRA, incluyendo la formación de la heterocromatina en telómeros4,5, ADN replicación6, promoviendo la recombinación homóloga entre cromosoma termina7,8 , 9, regulación de telomere estructura10y telómeros longitud homeostasis2,11,12,13. Por otra parte, las transcripciones TERRA interactúan con numerosos sitios de extratelomeric para regular la expresión génica generalizada en ratón de células madre embrionarias (ES)14. En consonancia con estas pruebas en situ hibridación de RNA fluorescencia (RNA-pescado) los análisis han demostrado que sólo un subconjunto de las transcripciones TERRA localizar en los telómeros1,2,15. Además, TERRA se ha divulgado para formar agregados nucleares de la localización en los cromosomas X e Y en células de ratón2,16. Estos resultados indican que las transcripciones TERRA experimentan dinámicas complejas dentro del núcleo. Comprender la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción.

El sistema MS2-GFP ha sido ampliamente utilizado para visualizar las moléculas de ARN en las células vivas de varios organismos17,18. Este sistema se ha utilizado previamente la etiqueta y visualizar moléculas TERRA solo telómeros en S. cerevisiae12,19. Mediante este sistema, fue demostrado recientemente que las transcripciones TERRA de levadura localización dentro del citoplasma durante la fase de post-diauxic cambio, sugiriendo que TERRA puede ejercer funciones extranuclear20. Recientemente hemos utilizado el sistema MS2-GFP para estudiar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células de cáncer21. Para ello, se emplea la herramienta de edición de genoma CRISPR/Cas9 para integrar secuencias MS2 en un telómero solo (telomere 15q, de ahora en adelante Tel15q) y se obtuvieron clones expresando tagged MS2 endógeno Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). La expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (MS2-GFP) que reconoce y se une MS2 ARN secuencias permite visualización de transcripciones TERRA telómero solo en la vida de las células de21. El propósito del protocolo ilustrado aquí es describir en detalle los pasos necesarios para la generación de clones de TERRA-MS2.

Para generar clones de TERRA-MS2, un cassette de MS2 se integra dentro de la región subtelomeric del telomere 15q, aguas abajo del TERRA promotor región y transcripción Inicio. El cassette de MS2 contiene un gen de resistencia a neomicina flanqueado por sitios lox-p, y su integración en subteloméricas 15q se realiza utilizando el sistema CRISPR/Cas9 del22. Después de transfección de MS2 cassette, solo los clones seleccionados e integración subtelomeric del cassette es verificado por PCR, ADN secuenciada y Southern blot. Clones positivos se infectan con un adenovirus que expresan Cre para quitar el marcador de selección en el cassette, dejando solamente secuencias de MS2 y un sitio de solo lox-p en subteloméricas 15q. Expresión de las transcripciones de MS2-tagged TERRA de Tel15q se verifica por RT-qPCR. Por último, se expresa la proteína de la fusión de GFP MS2 en TERRA-MS2 clones mediante infección retroviral para poder visualizar las transcripciones MS2-TERRA por microscopía de fluorescencia. Transcripciones TERRA pueden ser fácilmente detectadas por RNA-peces y proyección de imagen de células vivas mediante telomeric repeat-específico sonda1,2,15,23. Estos enfoques proporcionan información importante sobre la localización de la población total de moléculas TERRA en la resolución de la célula. La generación de clones que contienen secuencias de MS2 en un subteloméricas solo permitirá a los investigadores a estudiar la dinámica de las transcripciones TERRA solo telómeros en las células vivas, que ayudarán a definir la función y mecanismos de acción de TERRA.

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Protocolo

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1. Selección de Clones resistentes a la neomicina

  1. Cultivar células AGS en medio F-12_K del jamón (Kaighn) suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) a 37 ° C y 5% CO2. Transfectar las células en un 50-60% de confluencia con el sgRNA/Cas9 expresando el vector y el cassette de MS2 en un 1:10 cociente molar21.
    Nota: En un experimento paralelo, comprobar eficacia de transfección transferencia un vector de expresión de GFP (es decir, GFP Cas9 vector). Al menos debe alcanzar el 60-70% de eficiencia de transfección.
  2. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo con medio que contiene neomicina en concentración final de 0.7 μg/mL (medio selectivo).
    Nota: División de las células y les siembra en medio selectivo el día después de la transfección acelerará el proceso de selección. Todas las células transfectadas no va a morir inmediatamente. Si realiza la transfección en 6 placas de pozos, en cuyo caso cada bien en un 60% confluencia contendría aproximadamente 0,7 x 106 células, que las células pueden dividirse de un pozo único a un medio selectivo que contiene 10 cm plato al día siguiente.
  3. Mantener las células en medio selectivo para 7-10 días, cambiando el medio cada uno o dos días, hasta que los clones solo son accesibles.
  4. Selección de clones de células
    1. Preparar un plato bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25% en cada pozo.
      Nota: Prepare dos 96 placas bien en caso de que se espera que más de 96 clones recogidos.
    2. Con el uso de un microscopio, marque la posición de cada clon visible en el plato 10 cm haciendo un punto en la parte inferior del plato usando un marcador. Cada punto corresponderá a una colonia a ser recogido.
    3. Reemplazar el medio de cultivo con suficiente fosfato tampón salino (PBS) que forman una fina película de líquido sobre los clones y no dejar que las células secas durante la cosecha de clones.
    4. Escoge solo colonias con una pipeta de 10 μl. Fije la punta con 5 μl de tripsina a la Colonia y suelte lentamente la tripsina que permanecerá localizada en la Colonia. Permiten tripsina separar las células durante 1 minuto, luego raspar la Colonia con la punta y aspirar en la punta.
      Nota: Durante este procedimiento, cambiando el plato un poco de un lado así que disminuir el volumen de PBS alrededor de la Colonia burlan ayudará el proceso de selección evitando diluir la tripsina alrededor de la Colonia. Usando un anillo clon también puede ayudar a recoger solo clones.
    5. Coloque las células de la Colonia en un pocillo de la placa bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25%.
    6. Incubar 5 min a temperatura ambiente, luego llene el pozo con 150 μL de medio selectivo (medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL.
      Nota: Durante el tiempo de incubación otros clones se pueden seleccionar. Se recomienda escoger tantos clones como sea posible. Se recogen los clones más mayor será las posibilidades de identificación positivas.
    7. Una vez que todos los clones son seleccionados y transferidos en la placa de la pozo 96, permite a las células a crecer durante unos días en medio selectivo F - 12K de Ham (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL del medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C y 5% CO2, hasta llegar a 90% de confluencia.
  5. Partir de los clones
    1. Preparar tres 96 placas bien cubiertas con gelatina por agregar 100 μl de gelatina por pozo, incubar durante 30 min a temperatura ambiente, luego lavar dos veces con PBS. Estas placas se utilizará para la extracción de ADN (placa de ADN) y clon congelación (placas de congelación).
      Nota: La gelatina promoverá la fijación de las células y del ADN en los pocillos. En particular, la capa de gelatina permitirá el ADN pegue en el fondo de los pozos durante la extracción de ADN y lavar procedimientos (discutidos abajo). Durante el procedimiento de separación de clon, es recomendable utilizar una pipeta multicanal.
    2. Una vez que clones alcanzan el 90% de confluencia, aspirar el medio de cada pocillo de la placa de la pozo 96, lavar con PBS, Añadir 30 μl de tripsina 0.25% por pozo e incubar 5 min a 37 ° C.
      Nota: Clones crecerá a tasas diferentes, que también dependerá del número de células recogidas por clon. Por lo tanto, este paso se realizará durante los días cuando los clones diferentes a 90% de confluencia.
    3. Añadir 70 μl de medio selectivo por pozo, desbaratar grumos de células mediante pipeteo arriba y abajo dentro de los pozos, luego transferir 30 μl de 100 μl a la placa de ADN gelatinizada prellenada con 120 μl de medio selectivo por pozo y 30 μL en el ingenio prellenada gelatinizado de congelación las placas h 50 μl de medio (sin selección).
    4. Colocar la placa de la DNA en la incubadora y permitir a las células para crecer a 37 ° C y 5% de CO2 hasta 90% de confluencia.
    5. Añadir 80 μl de helado recién hecho 2 x congelación medio (80% FBS y 20% dimetil sulfóxido (DMSO)) a cada pocillo de la placa de congelación, añadir parafilm (rociado con etanol al 70%) sobre la placa para sellar cada pocillo, coloque la tapa en la parte superior y envolver la placa con papel de aluminio. Coloque las placas de congelación a-80 ° C.
    6. Agregar 90 μl de medio selectivo por bien a la placa bien 96 original que contiene los clones que se han dividido y no se en cultura hasta resultados de PCR. Esta placa se utilizará como placa de respaldo.

2. selección de Clones resistentes a la neomicina

  1. Extracción de ADN de la placa de ADN bien 96.
    1. Una vez que los clones cultivados en la placa de ADN llega a 90% de confluencia, lavar 2 veces con PBS y lyse con 50 μl de tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM de NaCl, 0.5% SDS y proteinasa K de 1 mg/mL). Cubra la placa con parafilm, sellando cada pocillo, coloque la tapa, cubierta con el abrigo de saran y colocar a 37 ° C durante la noche.
    2. Añada 100 μl de etanol frío (Et-OH) y una solución de NaCl (0,75 M de NaCl en 100% de etanol) a cada uno bien, precipitar por 6 horas o durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
    3. Quitar el Et-OH/NaCl solución invirtiendo la placa y lavar 3 veces con 200 μL de etanol al 70% por pozo.
    4. Añadir 25 μl de ARNasa A solución en agua destilada e incubar a 37 ° C durante 1 h.
  2. Utilice 3 μl de ADN genómico para la amplificación por PCR. Realizar investigación de la polimerización en cadena de los clones seleccionados usando las cartillas recocido dentro del gen de resistencia a neomicina y subteloméricas 15q. Amplificación por PCR se realiza utilizando enzimas de polimerasa estándar y protocolos PCR21.
    Nota: Las condiciones PCR para cartillas de MS2 (cartilla MS2-subtel15q-primer-S y MS2 como) y cartillas del CTR (primer CTR S y cartilla CTR como) son los siguientes: 98 ° C por 20 s como paso de desnaturalización y luego 34 ciclos a 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , en 25 μl de enzima polimerasa reacción mezclar (véase Tabla de materiales). Secuencias de la cartilla se indican en la tabla 1.
  3. Ejecutar reacciones de PCR en gel de agarosa y extracto de bandas PCR obtenidas de clones positivos mediante procedimientos de extracción de gel estándar (véase Tabla de materiales reactivos de extracción de gel).
  4. Realizar análisis de la secuencia de ADN del gel extraído del producto de PCR para la confirmación de la presencia de las secuencias de MS221.
    Nota: El análisis de secuencia pueden realizarse utilizando los cebadores utilizados para la detección de PCR.
  5. Proyección de la mancha blanca /negra meridional de clones positivos de PCR
    1. Crecen los clones positivos en PCR y detección de la secuencia de la original 96 bien placa (la copia de seguridad) a 6 platos bien en medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg por mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C 5% CO2.
      Nota: Como alternativa, si algunos de estos clones se han perdido, deshielo de una de las placas de congelación (véase protocolo 2.6).
    2. Una vez que los clones están en 90% de confluencia en la placa bien 6, lavan las células con PBS y añadir 250 μl de tampón de lisis que contienen 0,5 μg de proteinasa K por pozo.
    3. Raspar las células usando un raspador celular y transferir el lisado en un tubo de 1,5 mL.
    4. Incubar a 37 ° C por 16 h.
    5. Añadir 1 mL de etanol al 100%, agitar con fuerza y permitir el ADN precipitado por lo menos 2 horas o toda la noche a-20 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
    6. Vuelta a 13.400 x g a 4 ° C por 10 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Deje que el pellets aire seco a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.
    7. Resuspender el pellet de DNA en 50 μl de agua destilada conteniendo Rnasa A e incubar 1 h a 37 ° C.
    8. Digerir el 5-10 μg de DNA genómico con enzimas de restricción Brochothrix y BamHI (dos digestiones independiente) en el volumen de reacción de 100 μl por incubación de las reacciones de digestión a 37 ° C durante la noche.
    9. Ejecutar 4 μL de la digestión en gel de agarosa (agarosa 0,8%) para la confirmación de la digestión completa.
    10. Añadir 1/10 volumen de sodio acetato 3 M solución pH 5.2 y 2 los volúmenes de etanol al 100% a las reacciones de digestión de restricción e incubar por lo menos 2 horas o durante la noche a-20 ° C para precipitar el ADN.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
    11. Centrifugue a 13.400 x g a 4 ° C por 20 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Dejar secar el pellet al aire a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.
    12. Resuspender el pellet en 20 μl de agua destilada y el ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8% de la carga.
      Nota: Para una mejor resolución del ADN digerido, preparar un gel por lo menos 15 cm de largo y correr toda la noche en baja tensión (̴30 v). Debe optimizarse la electroforesis establecida.
    13. Al día siguiente, teñir el gel con un agente etiquetado ADN, como el bromuro de etidio en concentración final de 1 μl/10 mL, 30 min a temperatura ambiente y tomar una foto con una regla cerca el gel en un gel de instrumento de proyección de imagen.
    14. Establecer a la transferencia de ADN a una membrana de nylon y realizar hibridación de la membrana con una sonda de secuencia-específica de MS2 utilizando procedimientos estándar21.
    15. Descongelar los clones que son positivos en PCR, ADN secuenciada y Southern blot de una de las dos placas de congelación (ver siguiente paso).
  6. Descongelación de clones
    1. Preparar un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de precalentado Ham F - 12 K medio (de Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) por cada clon que se descongelarán.
    2. Retire una de las placas de congelación de-80 ° y añadir 100 μl de precalentado F12K medio completo al bien que contiene la copia positiva que se descongelarán.
      Nota: Este procedimiento debe realizarse rápidamente y la placa de la pozo 96 debe colocarse en hielo seco después de cada clon se descongele, para permitir que los otros clones que permanecen congelados. Esto es particularmente importante si necesitan ser descongelado del mismo plato bien 96 múltiples clones.
    3. Transferencia de las células al tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio y centrifugue a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Aspire el medio resuspender las células en 500 μl de medio de F12K completo precalentado y transferir cada clon a un único pozo de una placa bien 12.
  7. Eliminación del gen de resistencia a neomicina del cassette de MS2 integrado en subteloméricas 15q.
    1. Permita que los clones a crecer de una placa bien 12 a un plato de 10 cm en el medio F12K completo.
      Nota: Neomicina no se incluyera en el medio a menos que se indique lo contrario.
    2. Añadir el adenovirus Cre-expresar las células cultivadas en un plato de 10 cm en confluencia de 70% en 10 mL de medio completo F12K.
      Nota: Utilizando un adenovirus expresando GFP Cre permitirá la evaluación de la eficacia de la infección, que debe acercarse al 100%. El adenovirus replicación defectuosa se perderán después de pocos pasos en la cultura.
    3. 48 horas después de la infección, dividir las células en tres platos de 10 cm. Dos platos se utilizará para la verificación de la eliminación del gen neomicina por selección negativa, cultivo de las células que contienen neomicina medio (primer plato) y por Southern blot (segundo plato).
    4. El tercer plato que contiene el clon para congelación de células y la extracción de RNA de la cultura.

3. verificación de la TERRA-MS2 transcripción expresión por RT-qPCR

  1. Previa verificación de la eliminación del gen de neomicina, realizar extracción de RNA total de clones de TERRA-MS2 con solventes orgánicos (fenol y guanidina isothiocynate solución)21.
    1. Resuspender el ARN extraído de un plato de 10 cm en 100 μl de agua de dietil pirocarbonato (DEPC).
    2. Ejecutar 3 μl de ARN en un gel con ácido (MOPS) propanesulfonic denaturating (1% formaldehído que contienen) 1 x 3-(N-Morpholino) para verificar la concentración y la integridad del ARN. También analizar la concentración de RNA usando un espectrofotómetro.
    3. Tratar 3 μg de ARN con DNasa I con 1 unidad de la ADNsa I enzima en el volumen de reacción final de 60 μL.
    4. Incubar la reacción por 1 h a 37 ° C.
  2. Revertir la reacción y qPCR análisis de transcripción
    1. Añadir los siguientes componentes a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas: 2 μl de un 1 primer específico de TERRA μm, 1 μl de mezcla de dNTPs (10 mM), 6 μl de DNasa tratados con ARN (correspondientes a ̴300ng RNA). Ajustar el volumen a 13 μl con 4 μL de agua DEPC.
      Nota: Para que cada RNA a analizar, un segundo tubo que contiene los mismos reactivos pero una cartilla específica de referencia, en vez de primer específico de TERRA, debe estar preparado.
    2. Calienta la mezcla a 65 ° C durante 5 minutos e incubar en hielo durante al menos 1 minuto.
    3. Recoger el contenido de los tubos por centrifugación breve y añadir 4 μL de la enzima RT X 5 Buffer, 1 μl 0.1m dithiothreitol (DTT), 1 μl (4 unidades) de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales).
    4. Incubar las muestras a 42 ° C durante 60 min, luego use 2 μl de la reacción de RT para análisis de qPCR.
  3. Preparar la mezcla de reacción de qPCR en un volumen final de 20 μl de 10 μl de la mezcla principal de 2 x qPCR, 2 μl de cDNA plantilla, 1 μl de cebador forward (10 μm), 1 μl de cebador reverso (10 μm) y 6 μl de agua.
  4. Realizar la reacción de qPCR en un termociclador usando protocolos estándar21.

4. producción de un Retrovirus expresando GFP MS2

  1. Para generar el retrovirus expresando GFP MS2, transfectar 80% confluente phoenix packaging de células con una proteína de fusión de MS2-GFP expresar vectores de retrovirus (pBabe-MS2-GFP PURO) y un gen env expresando el vector (por ejemplo, pCMV-VSVG) con una relación molar de 4:1 de los dos vectores.
  2. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo (DMEM había suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina y pluma/Strep) con fresco medio que contiene 10mM butirato.
  3. Incubar durante 8 h a 37 ° C, 5% CO2, a continuación, sustituir el medio por medio fresco de cultivo desde que el virus será recogido.
  4. Después de 48 h, retire el medio de retrovirus que contienen las células de phoenix. Este medio puede ser utilizado directamente para la infección de clones de TERRA-MS2, en cuyo caso el medio del filtro a través de un filtro de 0.45 μm, agregar polibreno (concentración final de 30 μg/mL) y agregar a las células (en este caso el protocolo continúa en el paso 5). Por otra parte, retrovirus se puede precipitar en un tubo falcon de 50 mL agregando 1/5th volumen 50% PEG-8000/900 mm solución de NaCl y incubando toda la noche a 4 ° C en una rueda de rotor.
  5. Al día siguiente, las partículas de retrovirus de pellets por centrifugación a 2.000 x g durante 30 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en F12K medio sin suero.
    Nota: Las partículas de virus pueden se resuspendió en 1/100th del volumen de sobrenadante original. Una prueba de infección debe realizarse para verificar el volumen mínimo de retrovirus necesaria para infectar eficientemente las células.

5. visualización de TERRA-MS2 transcritos en células vivas

  1. TERRA-MS2 clones y células AGS WT en platos con fondo de cristal de la placa. En el día de la infección, añadir polibreno el medio (concentración final de 30 μg/mL) y los retrovirus expresando GFP MS2.
  2. Después de 24 horas, descartar el medio que contiene el virus y añadir medio fresco sin rojo de fenol.
  3. Analizar las células en un microscopio invertido usando el microscopio adecuado. Imagen de las células con un 100 X u objetivo de 60 X con apertura numérica grande (1.4 X) y usando una cámara sensible (EMCCD). Utilizar un sistema de control ambiental para mantener las muestras a 37 ° C y 5% CO2 durante la proyección de imagen.

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Resultados

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Figura 1 representa un resumen de la estrategia experimental. Los principales pasos del protocolo y un calendario indicativo para la generación de clones de TERRA-MS2 en células AGS se muestran (figura 1A). En el día 1, múltiples pocillos de una placa bien 6 son transfectados con el cassette de MS2 y sgRNA/Cas9 expresando vectores (se muestra en la figura 1B

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Discusión

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En este artículo presentamos un método para generar clones de células de cáncer humano que contiene secuencias de MS2 integradas en subteloméricas 15q. Usando estos clones, las moléculas etiquetadas MS2 TERRA transcritas de subteloméricas 15q son detectadas por microscopía de fluorescencia por la expresión de una proteína de la fusión de GFP MS2. Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de TERRA expresado desde una sola células del telómero en la vida de21. En este protocol...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran a intereses financieros que compiten

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos muy agradecidos al personal de la facilidad avanzada de la proyección de imagen del CIBIO en la Universidad de Trento y la instalación de microscopía de luz de BioOptics en el Max F. Perutz laboratorios (MFPL) en Viena. La investigación conduce a estos resultados ha recibido no financiación de la Stiftung Mahlke Obermann y séptimo programa marco de la Unión Europea para la investigación, desarrollo tecnológico y demostración en convenio de subvención 609431 de la CE. CE es apoyado por una beca Montalcini del Ministerio italiano de la Universidad de la educación y la investigación (MIUR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células AGS--Regalo de Christian Baron (Université de Montré al).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Medio de cultivo para células AGS
L-Glutamina CORNINGMT25005CIComponente del medio de cultivo celular
Solución de penicilina y estreptomicinaCORNING30-002-CIComponente del medio de cultivo
celular Suero fetal bovinoSigma AldrichF2442Componente del medio de cultivo celular
DMEM 1XGIBCO21068028medio de cultivo para célula fénix
CaCl2Sigma AldrichC1016utilizado en la transfección de células fénix
HEPESSigma AldrichH3375utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
KClSigma AldrichP9333utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
DextrosaSigma AldrichD9434utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
NaClSigma AldrichS7653utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS) y la precipitación de retrovirus
Na2HPO4SigmaAldrich S3264utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)
SOLUCIÓN DE TRIPSINA EDTA 1XCORNING59430Cutilizado en la división de células
DPBS 1XGIBCO14190250solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
DMSOSigma AldrichD8418Componente del medio de congelación celular (80% FBB y 20% DMSO)
G-418 Disulfatopara medioG4185fármaco de selección para 
Solución de gelatina BiorreactivoSigmaAldrich G1393contenido de placa de ADN de 96 pocillos y placa de congelación
Tris-baseFisher BioReagents10376743componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
EDTASigma AldrichE6758Componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
SDSSigma Aldrich71729Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
Proteinasa KThermo FisherAM2546Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico
ARNasa AThermo Fisher12091021Degradación del ARN durante la extracción de ADN
AgarosaSigma AldrichA5304Preparación de gel de ADN
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Reactivo de tinción utilizado para detectar muestras de ADN y ARN en etanol de gel de agarosa
Bioreactivos Fisher BP28184precipitación de ADN
Acetato de sodio Sigma Aldrich71196Utilizado para la precipitación de ADN a una concentración de 3M pH5.2
Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCRPromegaA9282Extracción de fragmentos de PCR de gel de agarosa durante el cribado por PCR de clones positivos para neomicina
TrizolAMBION15596018Disolvente orgánico utilizado para la extracción de ARN
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradación del ADN genómico a partir de ARN 
La mezcla de dNTPsInvitrogen10297018utilizada en reacciones RT y PCR
DTTInvitrogen707265MLutilizada en reacciones RT
pirocarbonato de dietiloSigma AldrichD5758utilizada para inactivar ARNasas en agua (dilución 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381Inhibidor de RNasa
MOPSSigma AldrichM9381preparación de gel de ARN
ParaformaldehídoMicroscopía Electrónica Sciences15710Preparación de gel de ARN desnaturalizante (1% de PFA en 1x MOPS)
Superscript III Transcriptasa inversaInvitrogen18080-093 Reacción deretrotranscripción
ADN polimerasa Pfu (recombinante)Thermo ScientificEP0501Reacción de PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR ReacciónqPCRde PB 20.14
El adenovirus Cre-GFPhttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTse utiliza para infectar clones de TERRA-MS2 con el fin de eliminar el gen neomycn
Butirato de sodioSigma AldrichB5887utilizado para promover la producción de partículas de retrovirus en células fénix
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitación de partes de retrovirus
35µ-Fondo de vidriopara platos Ibidi81158utilizado en análisis de imágenes de células vivas de clones de TERRA-MS2
de de BIOSYSTEMS

Referencias

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