Este protocolo describe el proceso de inmunostaining de las biopsias de succión rectal para la calretinina, la proteína S100 y el producto genético de proteína 9,5. Este novedoso método de diagnóstico adyuvante para la enfermedad de Hirschsprung tiene tasas de sensibilidad y especificidad preferibles.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es una enfermedad intestinal congénita que se manifiesta clínicamente como una incapacidad para pasar meconio en lactantes o como estreñimiento a largo plazo en niños. La biopsia de succión rectal (RSB) para determinar la ausencia de células ganglio y la hipertrofia neuronal es la prueba más precisa para el diagnóstico de la EH en la actualidad. La tinción de hematoxilina-eosina tradicional carece de sensibilidad y especificidad. La tinción de la acetilcolinesterasa no puede ser ampliamente utilizada debido a su complejo proceso. Nuestro novedoso protocolo de inmunostón para calretinina, proteína S100 y producto genético 9,5 (PGP 9.5), que realizamos en RSBs, exhibe tasas de alta sensibilidad y especificidad de 96,49% (intervalo de confianza de 95%, 0,88-0,99) y 100% (95% de confianza intervalo, 0,97-1.00), respectivamente. Los segmentos afectados por la EH a menudo se presentan como la ausencia de la expresión de calretinina, proteína S100, y PGP 9.5, que son marcadores de hipertrofia neuronal en el tejido submucosa. Este protocolo describe el proceso operativo detallado de este nuevo método de diagnóstico.
Introducción
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es un trastorno intestinal congénita común caracterizado por la falta de células ganglionada en diferentes segmentos del tracto intestinal distal1. El sistema nervioso entérico humano se forma cuando se completa la invasión de las células neuronales embrionarias. Si hay una perturbación del proceso y la invasión no se completa, el intestino distal del recién nacido se convierte en aganglionic2. Esta afección potencialmente mortal se denomina enfermedad de Hirschsprung. La proliferación, la motilidad y el crecimiento intestinal son los tres componentes principales de la colonización exit....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este protocolo fue aprobado por la Junta de ética de la investigación del hospital de la Unión de la Universidad de ciencia y tecnología de Huazhong.
1. biopsia de succión rectal
- Realiza la biopsia de succión rectal por un cirujano pediátrico bien entrenado y un asistente usando un sistema de biopsia rectal de succión Rbi2 después de obtener el consentimiento informado del tutor.
- Realizar RSB en pacientes que tienen las siguientes indicaciones: incapacidad para pasar meconio en lactantes o hinchazón a largo plazo con o sin estreñimiento en niños; niños con estreñimiento a largo plazo que necesiten aceite de parafina para c....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En total, 318 pacientes fueron inscritos en nuestro estudio. Todos los pacientes fueron sometidos a RSB, y los tejidos fueron manchados para calretinin, S100, y PGP 9.5. El diagnóstico basado en nuestro nuevo protocolo fue HD en 97 casos, no HD en 213 casos, y sospecha de EH en 8 casos. Entre los 132 pacientes quirúrgicos, 99 pacientes fueron diagnosticados con EH por inmunostaining de especímenes de espesor completo después de la cirugía. Las manchas S100 y PGP 9.5 mostraron que el 92% y.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí describimos un procedimiento que utiliza tres anticuerpos inmunohistoquímicos diferentes para teñir secciones de RBS para el diagnóstico de la EH. La sensibilidad de nuestro protocolo de diagnóstico fue del 96,49% (95% CI, 0,88-0.99), y la especificidad fue de 100% (95% IC, 0,97-1.00).
Los pasos más críticos del protocolo son la RSB y la reacción antígeno-anticuerpo. El tamaño de la biopsia determina la precisión de la coloración. Una pequeña biopsia no proporcionará suficiente tejido par.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Weibing Tang por su gran ayuda en el suministro del laboratorio de filmación. Este artículo es apoyado por la investigación de bienestar público, y los fondos especiales fueron recibidos de la salud nacional y planificación familiar de China (Grant no. 201402007).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anticuerpo de calretinina | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | anticuerpo: anticuerpo primario |
| S-100 anticuerpo | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | anticuerpo: anticuerpo primario |
| anticuerpo PGP9.5 | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | anticuerpo: |
| reactivo potenciador | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | anticuerpo: anticuerpo secundario A |
| anticuerpo secundario IgG anti-conejo/ratón | cabra MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | anticuerpo: anticuerpo secundario B |
| Kit de tinción DAB (que contiene reactivo A, B y C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | kit de tinción |
| Incubadora de calor | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrumento |
| Rbi2 succión biopsia rectal sistema | Aus Systems Pty Ltd, Australia del Sur, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | |
| micrótomo | Leica | leica RM2016 | instrumento |
| tampón de citrato de sodio de ácido cítrico(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | tampón de recuperación de antígenos |
| deshidratador de tejido patológico | wuhan junjie electronic Co. Ltd | instrumento | JT-12F |
Referencias
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advance....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Diagn stico de la enfermedad de Hirschsprungbiopsia rectal por succi ninmunotinci n de calretininatinci n de la prote na S100inmunotinci n de PGP9 5protocolo de inmunohistoqu micam todo de recuperaci n de ant genosan lisis mediante microscop a pticadetecci n de hipertrofia neuralausencia de c lulas ganglionares
