Artículo de método

Ensayando para el polifosfato inorgánico en bacterias

DOI:

10.3791/58818

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21 de enero de 2019

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1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

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Describimos un método simple para la rápida cuantificación de polifosfato inorgánico en diversas bacterias, incluyendo especies gramnegativas, grampositivas y micobacterias.

Resumen

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Polifosfato inorgánico (pólipo) es un polímero biológico encontrado en las células de todos los dominios de la vida y es necesaria para la virulencia y la respuesta de estrés en muchas bacterias. Hay una gran variedad de métodos para la cuantificación polyP en materiales biológicos, muchos de los cuales son mano de obra intensiva o insensible, limitando su utilidad. Aquí presentamos un método optimizado para la cuantificación de pólipo en bacterias, usando una extracción de columna de membrana de silicona optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras, digestión de pólipo con el específico de pólipo exopolyphosphatase ScPPX y detección de la fosfato libre resultante con un sensible análisis colorimétrico basado en ácido ascórbico. Este procedimiento es sencillo, barato y permite la cuantificación confiable de pólipo en diversas especies bacterianas. Se presenta la cuantificación de pólipo representativo de la bacteria gram-negativa (Escherichia coli), la bacteria del ácido láctico Gram-positivas (Lactobacillus reuteri) y las especies de micobacterias (Mycobacterium smegmatis). También incluimos un protocolo simple para la purificación de la afinidad del níquel de cantidades de mg de ScPPX, que no está actualmente disponible en el mercado.

Introducción

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Polifosfato inorgánico (pólipo) es un biopolímero lineal de unidades de fosfato phosphoanhydride-ligado que se encuentra en todos los ámbitos de la vida1,2,3. En diversas bacterias, pólipo es esencial para la respuesta de estrés, motilidad, formación de biopelículas, control del ciclo celular, resistencia antibiótica y virulencia4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudios de metabolismo del polyP en bacterias por lo tanto tienen el potencial para producir penetraciones fundamentales en la capacidad de las bacterias que causan enfermedad y prosperan en ambientes diversos. En muchos casos, sin embargo, los métodos disponibles para cuantificación de pólipo en las células bacterianas son un factor limitante en estos estudios.

Hay varios métodos usados actualmente para medir los niveles de pólipo en materiales biológicos. Estos métodos generalmente involucran dos pasos distintos: extracción de pólipos y cuantificar el pólipo presentes en esos extractos. El método estándar de oro actual, desarrollado para la levadura Saccharomyces cerevisiae por Bru y colaboradores12, pólipo extractos junto con ADN y ARN con fenol y cloroformo, seguido por la precipitación del etanol, el tratamiento con Desoxirribonucleasa (DNasa) y ribonucleasa (Rnasa) y digestión del pólipo purificado resultante con la S. cerevisiae degradantes pólipo enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 fosfato libre, que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico basados en verde malaquita. Este procedimiento es altamente cuantitativa pero que requieren mucho trabajo, limitar el número de muestras que puede procesar en un solo experimento y no está optimizado para las muestras bacterianas. Otras personas han reportado extracción de pólipo de una variedad de células y tejidos utilizando granos de sílice "(glassmilk del) o silicona membrana columnas6,14,15,16,17, 18. Estos métodos no extraer eficientemente pólipo (menos de 60 unidades de fosfato) de cadena corta12,14,15, aunque esto está de menos preocupación por las bacterias, que generalmente se cree que sintetizan principalmente Pólipo de cadena larga3. Los métodos antiguos de extracción de pólipo usando ácidos fuertes19,20 se ya no utilizan, ya que el pólipo es inestable bajo condiciones ácidas12.

También hay una variedad de métodos reportados para la cuantificación del pólipo. Entre las más comunes es 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), un colorante fluorescente más típicamente usado para teñir ADN. Complejos de DAPI-pólipo tienen maxima de excitación y de emisión de fluorescencia diferentes a DAPI-ADN complejos21,22, pero hay considerable interferencia de otros componentes celulares, incluyendo el ARN, nucleótidos y inositol los fosfatos12,15,16,23, reducción de la especificidad y sensibilidad de las mediciones de pólipo realizadas con este método. Alternativamente, se pueden convertir en trifosfato de adenosina (ATP) mediante purificada Escherichia coli pólipo y Adenosín difosfato (ADP) cinasa de pólipo (PPK) y el ATP resultante cuantificadas usando luciferasa14,17 ,18. Esto permite la detección de cantidades muy pequeñas de pólipo, pero requiere dos pasos de la reacción enzimática y luciferin y ADP muy puro, que son reactivos caros. ScPPX específicamente resúmenes de pólipo de fosfato libre6,12,13,24, que pueden detectarse mediante métodos más simple, pero ScPPX es inhibida por el DNA y el RNA12, necesidad tratamiento de DNasa y Rnasa de pólipo que contiene extractos. Ni PPK ni ScPPX están comercialmente disponibles, y purificación de PPK es relativamente complejo25,26.

Pólipo en lysates de la célula o extractos también puede ser visualizado en geles de poliacrilamida por negativo27,28,29,30, un método que permite la evaluación de la longitud de la cadena, pero es la coloración de DAPI bajo rendimiento y mal cuantitativa.

Ahora divulgamos un ensayo rápido, barato, medio rendimiento pólipo que permite la cuantificación rápida de pólipo niveles en diversas especies bacterianas. Este método comienza por lisis de las células bacterianas a 95 ° C de (GITC) el isotiocianato de guanidina 4 M14 para inactivar fosfatasas celulares, seguidas por una extracción de columna de membrana de sílice optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras. El extracto que contiene el pólipo resultante luego se digiere con un exceso de ScPPX, eliminando la necesidad para el tratamiento de DNasa y Rnasa. Incluimos un protocolo para la purificación de afinidad níquel directa de cantidades de mg de ScPPX. Finalmente, derivado de pólipo libre fosfato es cuantificado con un ensayo colorimétrico simple, sensible, basada en el ácido ascórbico24 y normalizado a la proteína celular total. Este método optimiza la medición del polyP en células bacterianas, y demostrar su uso con especies representativas de las bacterias Gram negativas, bacterias Gram-positivas y micobacterias.

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Protocolo

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1. purificación de levadura Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformar la tensión de sobreexpresión de proteína de e. coli BL21(DE3)31 con el plásmido pScPPX26 por electroporación32 o33de la transformación química.
  2. Inocular 1 L de caldo de lisogenia (LB) que contiene 100 ampicilina de μg mL-1 en un matraz de 2 L unbaffled con una sola Colonia de BL21(DE3) que contienen pScPPX2 e incubar durante la noche a 37 ° C sin agitación, a una absorbancia de 600 nm (un600) de aproximadamente 0.3, medido en un espectrofotómetro.
  3. Iniciar la cultura de agitación (180 rpm) e incubar durante 30 min a 37 ° C, tiempo durante el cual las células se crecen a un A600 de 0.4 - 0.5.
  4. Añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y un adicional 100 μg mL-1 ampicilina, luego incubar durante 4 h a 37 ° C con agitación a 180 rpm.
    Nota: Este protocolo de sobre-expresión genera una gran cantidad de ScPPX soluble. Sin embargo, la sobreexpresión de ScPPX es muy indulgente, y se han utilizado una variedad de otros protocolos comunes de la sobreexpresión de la proteína a purificar con éxito ScPPX.
  5. Transferir las células a una botella de centrífuga de 1 L y cosecha por centrifugación durante 20 minutos a 5000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y transferir el precipitado de células a un tubo cónico de 50 mL.
    Nota: Gránulos de la célula pueden almacenarse indefinidamente a-80 ° C.
  6. Descongelar la pelotilla en el hielo, luego resuspender en 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 5 mM (pH 8) para un volumen total de aproximadamente 10 mL.
  7. Añadir lisozima de (concentraciones finales) 1 mg mL-1 , 2 mM de MgCl2y 50 unidades mL-1 de una endonucleasa de degradación de RNA y DNA (véase Tabla de materiales) e incubar por 30 min en hielo.
    Nota: ScPPX se une a los ácidos nucleicos (datos no mostrados), por tratamiento de nucleasa es esencial durante la purificación.
  8. Utilizando un sonicador con una micropunta (véase Tabla de materiales), lyse las células por 2 ciclos de sonicación en hielo al 50% de potencia, pulsación 5 s s a y 5, con un descanso de 2 minutos entre los ciclos.
    Nota: Use protección auditiva adecuada durante la sonicación. Igualmente para el caso de sobreexpresión, una variedad de métodos de lisis de células son aceptables para la purificación del ScPPX.
  9. Eliminar la suciedad insoluble por centrifugación el lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante resultante (aproximadamente 10 mL) a través de un filtro de jeringa de acetato de celulosa de 0,8 μm poro tamaño.
  10. El lisado en cargado de níquel 5 mL quelantes columna de carga (véase Tabla de materiales) usando una bomba peristáltica o una jeringa grande.
  11. Enjuagar la columna con 50 mL de imidazol de 5 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 50 mM (pH 8).
  12. Enjuagar la columna con 50 mL de imidazol de 20 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 50 mM (pH 8).
  13. Responsables ScPPX con 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol de 0,5 M (pH 8), que recoge 15 fracciones de 1 mL. Prueba estas fracciones elución para contenido proteínico con la proteína de Bradford ensayo34 (véase Tabla de materiales) y un gel de SDS-PAGE35 para confirmar que fracciones contienen ScPPX purificada (peso molecular = 45 kDa).
  14. Las fracciones que contiene pura ScPPX de la piscina y ajustar la concentración de la proteína combinada sobre 2 mg mL-1 con 50 mM HEPES y 0,5 M de NaCl. Concentraciones más altas de proteínas pueden precipitar en el paso siguiente.
  15. Intercambiar la ScPPX purificada en búfer de almacenamiento (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glicerol al 10% [v/v]) por diálisis. Combinado ScPPX de fracciones en una longitud sellada de 12.000-14.000 Da peso molecular límite diálisis membrana de la tubería (véase Tabla de materiales) y suspender en 1 L de tampón de almacenamiento con continua agitación a 4 ° C por al menos 4 h. Repita este paso con dulce buffer de almacenamiento para un total de 3 cambios de tampón.
  16. Transferencia de la proteína purificada, dializada, a un tubo de centrífuga o tubos y centrifugar durante 20 minutos a 20.000 x g a 4 ° C para eliminar cualquier agregados insolubles. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mL limpio.
  17. Ajustar la concentración de la ScPPX purificada a 1 mg mL-1 con el tampón para almacenamiento, Añadir 0.1% (p/v) libre de proteasa de seroalbúmina bovina (BSA; concentración final) y almacenar hasta por 6 meses a 4 ° C.
    Nota: ScPPX pierde más del 90% de su actividad cuando es congelado13.

2. recolección de muestras para la extracción de polifosfato

  1. Crecen las bacterias en las condiciones de interés para la determinación de contenido de pólipo. De este protocolo, cultivar Lactobacillus reuteri36 durante la noche a 37 ° C sin agitación en medio de inducción (MEI) de enzima málico37 sin cisteína (MEI-C).
  2. Suficientes células por centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 50 – 100 μg de proteína celular total de la cosecha (véase paso 3 más abajo). Para e. coli, se trata de 1 mL de una cultura de la fase de registro en un A600 de 0.2 - 0.4. De L. reuteri, esto es 1 mL de un cultivo durante la noche. Ajustar según sea necesario para otras especies de interés.
  3. Eliminar completamente el sobrenadante de los gránulos de la célula.
  4. Resuspender el pellet celular en 250 μl de tampón de lisis GITC (isotiocianato de guanidina de 4 M, 50 mM Tris-HCl, pH 7) y lyse por incubación a 95 ° C durante 10 minutos lisados tienda a-80 ° C.
    Nota: Ser coherente con el tiempo de lisis, ya que la incubación prolongada a altas temperaturas puede causar degradación del pólipo por hidrólisis38. Lisados pueden almacenarse indefinidamente a-80 ° C.
    PRECAUCIÓN: Isotiocianato de guanidina es una sal caotrópico y debe ser manejado con guantes y desechado como residuos peligrosos.

3. el contenido de proteína de Lysates de la célula de medición

  1. Preparar normas de BSA que contiene 0, 0.1, 0.2 y 0.4 mg mL-1 de BSA en tampón de lisis GITC.
    Nota: Es importante que los estándares de la BSA en GITC, desde GITC influye en el desarrollo del color del ensayo de Bradford. Normas de la BSA pueden almacenarse indefinidamente a-20 ° C.
  2. Alícuota y 5 μl de lisados de células descongeladas, bien mezclado y de las normas de la BSA para separar pozos de una placa de 96 pocillos claro.
  3. Añadir 195 μl de reactivo de Bradford34 a cada pozo y medir la absorbancia a 595 nm (un595) en un lector de placas (véase Tabla de materiales).
  4. Calcular la cantidad de proteína en cada pozo por comparación con la curva estándar de BSA, usando la fórmula y = mx + b, donde y es un595, x es μg de BSA, m es la pendiente de la curva estándar, y b es la intersección de la curva estándar. Multiplicar el valor resultante por 0.05 para determinar el mg total de proteína en cada muestra.

4. extracción de polifosfato

  1. Añadir 250 μl de etanol al 95% para cada muestra lisada GITC y vortex para mezclar.
  2. Esa mezcla se aplican a una columna de spin de membrana de silicona y centrifugar durante 30 s a 16.100 x g.
  3. Deseche el flujo a través, luego agregar 750 μl de 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% de etanol y centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
  4. Deseche el flujo y centrifugar durante 2 min a 16.100 x g.
  5. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y agregar 150 μL de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego eluir pólipo por centrifugación durante 2 min a 8.000 x g.
    Nota: Si lo desea, los eluatos pueden almacenarse a-20 ° C durante al menos 1 semana.

5. digerir polifosfato

  1. Preparar estándares que contienen 0, 5, 50 o fosfato de potasio de 200 μm en 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Nota: Normas de fosfato de potasio pueden almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
  2. Alícuotas de 100 μl de cada fosfato estándar y extrae muestras de pólipo en pocillos distintos de una placa de 96 pocillos claro.
  3. Preparar una mezcla maestra que contiene (por muestra): 30 μl de 5 x ScPPX reacción buffer (100 mM Tris-HCl 25 mM MgCl2acetato de amonio 250 mM, pH 7,5)1319 μl de H2O y 1 μl de ScPPX purificada (1 mg mL-1).
  4. Añadir 50 μl de la master mix a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar por 15 min a 37 ° C.
    Nota: Si lo desea, las muestras digeridas pólipo pueden almacenarse a-20 ° C indefinidamente.

6. detección de fosfato libre24

  1. Preparar solución de detección de base disolviendo 0,185 g de tartrato de antimonio y potasio en 200 mL de agua, agregar 150 mL de 4 N H2hasta4, entonces agregando 1,49 g de heptamolibdato de amonio. Revuelva para disolver y luego llevar a un volumen final de 456 mL. Filtrar la solución para eliminar partículas y almacenar protegido de la luz a 4 ° C durante 1 mes.
  2. Prepare una solución de ácido ascórbico de 1 M. Almacenar protegido de la luz a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Preparar una acción de trabajo fresca de solución de detección cada día mezclando 9,12 mL de solución de detección de base con 0,88 mL de ácido ascórbico de 1 M. Deje que la solución de detección llegue a temperatura ambiente antes de usar.
  4. Añadir 50 μl de solución de detección para cada muestra y el patrón en la placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos permitir el desarrollo del color.
  5. Medir la absorbancia a 882 nm con un lector de placas y calcular la concentración de fosfato de cada muestra en comparación a la curva estándar de fosfato de potasio.
    PRECAUCIÓN: La solución de detección contiene ácidos fuertes y sales tóxicas. Utilice guantes y tratar el exceso de solución como residuos tóxicos.

7. calcular el contenido celular de polifosfato

  1. Convertir las concentraciones de fosfato en paso 6.5 nanomoles de fosfato derivado de pólipo en cada célula entera lisado según la siguiente fórmula:
    Pólipo de nmol = 1.5 x (fosfato de μm / 10)
    Nota: El método basado en la curva estándar en el paso 6 determina la concentración de fosfato (en μm) en cada 100 μl de muestra pólipo alícuotas en el paso 5.2. Para convertir esta concentración en un número de nmol, 100 μl se divide por 106 para dar un volumen en L, multiplicado por la concentración (μmol L-1), a continuación, multiplicado por 1.000 (el número de nmol en un μmol). Esto reduce a dividiendo la concentración por 10. El volumen total del extracto preparado en el paso 4 es 150 μL, por lo que es necesario multiplicar el valor resultante por 1,5 para calcular la nmol de fosfato presente en el extracto entero.
  2. Normalizar el contenido celular del pólipo a la proteína celular total dividiendo el pólipo nmol por el mg de proteína total en cada muestra se determinó en el paso 3.4. Niveles de pólipo se expresan en términos de la concentración de fosfato libre derivados de pólipos individual.
    Nota: En algunos casos, la cantidad de derivados de pólipo fosfato presente en una muestra puede caer fuera del rango lineal de la curva estándar de fosfato (paso 6.5). Si los niveles de pólipo están muy altos, el efluente que contiene el pólipo exceso de paso 4.6 puede ser diluido 1:10 o 1: 100, según sea necesario y luego mide otra vez como se describe en los pasos 5 a 7.

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Resultados

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Los pasos del Protocolo se muestra un diagrama en forma simplificada en la figura 1.

Para demostrar el uso de este protocolo con bacterias Gram-negativas, tipo salvaje de e. coli MG165539 fue crecido en fase logarítmica media en rico medio LB a 37 ° C con agitación (200 rpm), luego enjuagar e incubado por un adicional 2 h en morpholinopropanesulfonate-buffered (MOPS)...

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Discusión

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El protocolo descrito aquí simplifica y acelera la cuantificación de los niveles de pólipo en diversas bacterias, con un conjunto típico de 24 muestras tomando aproximadamente 1,5 h a totalmente proceso. Esto permite la detección rápida de muestras y análisis de bibliotecas mutantes y simplifica experimentos cinéticos miden la acumulación de pólipo en el tiempo. Hemos demostrado que el protocolo funcione eficazmente a los representantes de tres filos diferentes: proteobacteria, firmicutes y actinobacteria, que son conoci...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este proyecto fue apoyado por la Universidad de Alabama en Birmingham Departamento de Microbiología Inicio fondos y NIH subsidio R35GM124590 (MJG) y NIH subsidio R01AI121364 (FW).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plásmido pScPPX2Addgene112877disponible para instituciones académicas y otras instituciones sin fines de lucro
Caldo LBFisher ScientificBP1427-2E. coli medio de crecimiento
ampicilinaFisher ScientificBP176025
isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
Tampón HEPESBiotechnologyH-400-1
hidróxido de potasio (KOH)Fisher ScientificP250500para ajustar el pH de soluciones tamponadas con HEPES
cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazolFisher ScientificO3196500
lisozimaFisher ScientificAAJ6070106
cloruro de magnesio (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Nucleasa universalFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) es un sustituto aceptable
Modelo 120 DesmembradorSónico Fisher ScientificFB-120otros métodos de lisis celular (por ejemplo, French Press) también pueden ser efectivos
5 mL HiTrap quelante Columna HPLife Sciences 17040901cualquier columna de cromatografía de afinidad de níquel o resina podría ser sustituida
sulfato de níquel (II) hexahidratadoFisher ScientificAC415611000para cargar la columna HiTrap
0.8 y micro; m tamaño de poro filtros de jeringa de acetato de celulosaFisher Scientific09-302-168
Bradford reactivoBio-Rad5000205
tampón TrisFisher ScientificBP1525
Spectrum  Spectra/Por 4 RC Tubo de membrana de diálisis de 12.000 a 14.000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Botras membranas de diálisis con MWCO < 30.000 Da también deberían funcionar
ácido clorhídrico (HCl)Fisher ScientificA144-212para ajustar el pH de las soluciones tamponadas con Tris
cloruro de potasio (KCl)Fisher ScientificP217500
glicerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS mezcla de medioTeknovaM2101E. coli
medio de crecimiento glucosaFisher ScientificD161
fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
extracto de levadura deshidratadaFisher ScientificDF0886-17-0
triptonaFisher ScientificBP1421-500
sulfato de magnesio heptahidratadoFisher ScientificM63-50
sulfato de manganeso monohidratoFisher ScientificM113-500
guanidina isotiocianatoFisher ScientificBP221-250
albúmina sérica bovina (sin proteasa)Fisher ScientificBP9703100
placas transparentes de fondo plano de 96 pocillosSigma-AldrichM0812-100EAcualquier placa transparente de 96 pocillos funcionará
Tecan M1000 Lector de placas infinitasTecan, Inc.No aplicablecualquier lector de placas capaz de medir la absorbancia a 595 y 882 nm funcionará
etanolFisher Scientific04-355-451
columnas de centrifugación de membrana de síliceEpoch Life Science1910-050/250
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Fisher ScientificBP120500
tubos de microfuga de 1,5 mLFisher ScientificNC9580154
acetato de amonioFisher ScientificA637-500
tartrato de antimonio y potasioFisher ScientificAAA1088922
4 N ácido sulfúrico (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
heptamolibdato de amonioFisher ScientificAAA1376630
ácido ascórbicoFisher AC401471000
Gold GE por Científico

Referencias

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