Artículo de método

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

DOI:

10.3791/58820

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31 de enero de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar partículas nucleosoma en el nivel de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica estática y Time-lapse (AFM) técnicas de imagen. El método de funcionalización de superficies descrito permite la captura de la estructura y la dinámica de los nucleosomas en alta resolución a escala nanométrica.

Resumen

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La cromatina, que es una cadena larga de subunidades del nucleosoma, es un sistema dinámico que permite tales procesos críticos como la replicación del ADN y transcripción para tomar lugar en las células eucariotas. La dinámica de los nucleosomas proporciona acceso al ADN, por mecanismos de replicación y la transcripción y crítica contribuye a los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones de la cromatina. Una sola molécula estudios tales como microscopia de fuerza atómica (AFM) la proyección de imagen han contribuido significativamente a nuestra comprensión actual del papel de la estructura del nucleosoma y dinámica. El actual protocolo describe los pasos que permite técnicas de imagen AFM alta resolución estudiar las propiedades estructurales y dinámicas de los nucleosomas. El protocolo es ilustrado por datos AFM obtenidos para los nucleosomas centrómero en la cual las histonas H3 se sustituye por su proteína de centrómero homólogo (CENP-A). El protocolo comienza con el ensamblaje de los nucleosomas mono usando un método de dilución continua. La preparación del substrato de mica funcionalizado con silatrane de aminopropil (APS-mica) que se utiliza para la proyección de imagen de nucleosoma es crítica para la visualización de AFM de nucleosomas que se describe y se proporciona el procedimiento para preparar el sustrato. Nucleosomas depositados sobre la superficie de la mica de la APS son reflejados primero usando estático AFM, que captura una instantánea de la población de nucleosoma. Del análisis de estas imágenes, estos parámetros como el tamaño del ADN envuelto alrededor de los nucleosomas se pueden medir y también se detalla este proceso. La AFM Time-lapse de procedimiento en el líquido se describe para el AFM de alta velocidad Time-lapse que puede capturar varios marcos de la dinámica de nucleosoma por segundo. Por último, el análisis de la dinámica del nucleosoma que permite la caracterización cuantitativa de los procesos dinámicos es descrito e ilustrado.

Introducción

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En las células eucariotas, el ADN es altamente condensada y organizado en cromosomas. 1 el primer nivel de organización del ADN en un cromosoma es el conjunto de nucleosomas en que 147 PB de ADN se envuelve firmemente alrededor de un núcleo del octámero de histonas. 2 , 3 partículas nucleosoma montan en una larga molécula de ADN formando una matriz de cromatina que luego es organizada hasta que se forma una unidad muy compacta cromosoma. 4 el desmontaje de la cromatina proporciona el acceso para liberar ADN requerido por los procesos celulares críticos como gene transcripción genoma replicación y, lo que sugiere que la cromatina es un sistema altamente dinámico. 5 , 6 , 7 comprensión de las propiedades dinámicas del ADN en distintos niveles de cromatina es críticamente importante para dilucidar los procesos genéticos a nivel molecular donde los errores pueden conducir a muerte celular o el desarrollo de enfermedades como el cáncer. 8 una característica de la cromatina de gran importancia es la dinámica de los nucleosomas. 9 , 10 , 11 , 12 la alta estabilidad de estas partículas ha permitido la caracterización estructural mediante técnicas cristalográficas. 2 qué falta de estos estudios son los detalles dinámicos de nucleosomas como el mecanismo de ADN desenvolver desde el núcleo de histonas; la vía dinámica que se requiere para los procesos de transcripción y replicación. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 además, proteínas especiales llamadas factores de remodelación se han demostrado para facilitar el desmontaje de partículas nucleosomal17; sin embargo, la dinámica intrínseca de los nucleosomas es el factor crítico en este proceso que contribuye al proceso de desmontaje todo. 14 , 16 , 18 , 19

Técnicas de una sola molécula como fluorescencia de una sola molécula19,20,21, captura óptica (pinzas)13,18,22,23 y AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 han sido fundamentales en la comprensión de la dinámica de los nucleosomas. Entre estos métodos, el AFM se beneficia de varias características únicas y atractivas. AFM permite visualizar y caracterizar nucleosomas individuales así como los arreglos de discos más27. Imágenes de AFM, características importantes de la estructura del nucleosoma como la longitud del ADN enrollado alrededor del núcleo de histonas pueden ser medido 10,14,26,28; un parámetro fundamental para la caracterización de la dinámica desenvoltura nucleosoma. Más allá de AFM estudios han revelado los nucleosomas para ser sistemas altamente dinámicos y que espontáneamente puede Desempaquete el ADN desde el núcleo de histonas14. El desenvolver espontánea del ADN de los nucleosomas fue visualizado directamente por AFM operando en el modo time-lapse cuando la proyección de imagen se realiza en soluciones acuosas 14,26,29.

La llegada de la alta velocidad instrumentación de AFM (HS-AFM) lapso de tiempo posible visualizar el proceso de desembalaje de nucleosoma en el milisegundo de la escala de tiempo 14,15,24. HS-AFM 16,30 los estudios recientes de nucleosomas específicos centrómero revelado varias características novedosas de los nucleosomas en comparación con el tipo canónico. Nucleosomas de centrómero constituyen de un centrómero, una pequeña parte del cromosoma cromosoma segregación31críticamente importante. A diferencia de nucleosomas canónicos en cromatina a granel, el núcleo de histonas de nucleosomas centrómero contiene histonas de CENP-A en lugar de la histona H332,33. Como resultado de esta sustitución de las histonas, envoltura del ADN en los nucleosomas centrómero es de ~ 120 bp en lugar de los 147 ~ bp de nucleosomas canónicos; una diferencia que puede llevar a distintas morfologías de los centrómero y nucleosomas canónicos matrices34, sugiriendo que la cromatina del centrómero sufre más dinámica en comparación con el bulto uno. La dinámica novedosa de nucleosomas centrómero en estudios de30 16,HS-AFM ejemplifican la oportunidad proporcionada por esta técnica de una sola molécula para visualizar directamente las propiedades estructurales y dinámicas de nucleosomas. Ejemplos de estas características se discuten brevemente e ilustrados al final del documento. Avances debido al desarrollo de nuevos protocolos para la proyección de imagen de AFM de nucleosomas, así como las modificaciones de los métodos existentes. El protocolo aquí descrito pretende hacer accesible a cualquier persona que quisiera utilizar estas técnicas en sus investigaciones de cromatina estos emocionantes avances en estudios de nucleosoma AFM de una sola molécula. Muchas de las técnicas descritas son aplicables a problemas más allá del estudio de los nucleosomas y pueden ser utilizados para investigaciones de otras proteínas y ADN de interés. Algunos ejemplos de este tipo de aplicaciones pueden encontrarse en publicaciones35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 y las perspectivas de los estudios AFM de se dan varios sistemas biomoleculares en comentarios29,50,51,53,54.

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Protocolo

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1. continua dilución Asamblea de Mono-nucleosomas

  1. Generar y purificar un sustrato de ADN aproximadamente 400 bp que contiene un nucleosoma de Widom 601 off centrado en la secuencia de posicionamiento. 55
    Nota: Para limitar la formación indeseada de di-nucleosomas, cada 'brazo' que flanquean la secuencia de colocación no debe exceder 150 ~ bp.
    1. Usar el plásmido pGEM3Z-601 junto con los cebadores diseñados y amplificar el ADN substrato usando PCR. Para el substrato de bp 423 con 122 y 154 longitudes de brazo bp utilizado aquí, utilice hacia adelante (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') y reversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') cartillas.
    2. Agregar a precalentado de tubos con la mezcla de reacción a un termociclador a 95 ° C. Ejecutar el siguiente programa para los 33 ciclos después de una desnaturalización inicial por 5 min a 95 desnaturalización ° C: 30 s a 95 ° C, 30 s recocido a 49 ° C, 35 extensión de s a 72 ° C. Establecer una extensión final a 72 ° C por 10 min siguiendo los ciclos de 33.
    3. Purificar el ADN de la mezcla PCR usando un PCR Purification Kit disponible comercialmente. Cuando se eluye el ADN de la columna de limpieza PCR, utilizar 10 mM de tampón Tris (pH 7,5) en lugar del kit suministrado tampón de elución.
      Nota: Tenga mucho cuidado no para transferir reservas entre los pasos de purificación. Un eluyente contaminada puede causar problemas río abajo cuando medir concentración de ADN y puede alterar la concentración de sal a partir de la mezcla de Asamblea de nucleosoma.
  2. Determinar la concentración de ADN midiendo la absorbancia de la DNA purificada a 260 nm.
    1. Recoger un espacio en blanco en el espectrofotómetro UV usando sólo el 10 mM Tris pH 7.5 tampón de elución. Recoge una medida de la DNA purificada.
  3. Con la concentración determinada, alícuota 25 pmol de la DNA purificada en un tubo de microcentrífuga de 0.6 mL y colóquelo en una centrífuga de vacío hasta que la solución es apenas visible; se trata normalmente de 30 min a 1 h.
    Nota: El sustrato de la ADN está listo para el montaje de nucleosoma. De lo contrario, puede detener aquí el protocolo y el ADN almacenado a-20 ° C hasta su uso.
  4. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene los 25 pmol de ADN en el hielo y agregar los componentes de la Asamblea de nucleosoma en la tabla 1, en el orden indicado. Cuando se han agregado todos los componentes, retire la mezcla del hielo e incubar a temperatura ambiente (RT) por 30 min.
    Nota: Es fundamental que el contenido de sal del buffer stock histona se considera cuando calcular el NaCl necesaria para alcanzar la concentración final de 2 M. 15 , 56
  5. Montar los nucleosomas al reducir la concentración de sal de 2 M de la mezcla a 200 mM, utilizando una dilución de tipo continuo. 57
    1. Llene una jeringa con 100 μl de tampón de dilución que contiene 10 mM de Tris pH 7.5 y colóquelo en una bomba de jeringa.
    2. Dirigir la aguja de la jeringa a través de un agujero previamente perforado en la tapa del tubo de microcentrífuga, asegurando un contacto se hace con la mezcla de montaje (figura 1).
    3. Funcionar la bomba de jeringa a una velocidad de 0,75 μl/min 120 min.
      Nota: La solución resultante de μl 100 contiene 250 nucleosomas nM y 200 mM de NaCl.
    4. Transferir la mezcla a un botón de diálisis de 10 K MWCO y dializo contra 200 mL de un tampón baja sal previamente refrigerada (4 ° C) que contiene 10 mM Tris pH 7.5, EDTA 0.25 mM y 2,5 mM NaCl, durante 1 hora a 4 ° C.
  6. Para evaluar el contenido de la histona de la Asamblea del nucleosoma, preparar un gel de SDS-PAGE discontinuo con una separación de 15% y 6% apilado como se describió anteriormente30.
    1. Alícuota 10-20 μl del nucleosoma de stock a un tubo de microcentrífuga y añadir 4 x Laemmli Sample Buffer a una concentración de trabajo de 1-2 x. 58
    2. Como control, repita esta preparación en un tubo de microcentrífuga separadas 1-2 μg de la acción de la histona. Calentar las muestras a 95 ° C durante ~ 5 minutos.
    3. Cargar las muestras en los carriles adyacentes uno al otro en el gel. Añadir el tampón de muestra a los carriles no utilizados para promover la migración de la banda incluso.
    4. Correr el gel a 65 V hasta el frente de tinte se desplaza por el gel de apilamiento. Cuando se alcanza el gel de separación, aumentar a 150 V y correr hasta el frente de tinte ha migrado completamente del gel.
    5. Desmontar el equipo de electroforesis y transferencia suavemente el gel a un recipiente de tinción llenado de dd H2O. Deje el gel durante 5 minutos con agitación suave. Repita este proceso dos veces más con dulce dd H2O usada cada vez.
      Nota: La tinción de Coomassie utilizada en este Protocolo no requiere los pasos habituales de fijación para las manchas de Coomassie (véase Tabla de materiales). Si se utiliza otra preparación de Coomassie, ajustar los pasos de fijación según sea necesario.
    6. Saque el agua del enjuague final y añadir suficiente tinte para cubrir el gel. Deje el gel con agitación suave durante al menos 1 h.
      Nota: Para la agitación, el recipiente de tinción puede colocarse en cualquier aparato que promueve el movimiento de la mancha sobre el gel, también manteniendo el gel cubierto en líquido.
    7. Quitar la mancha del contenedor y lavar el gel con dd H2O. reemplazar el dd H2O y remojar el gel por 30 min con agitación suave. (El gel debe aparecer como se muestra en la figura 2, con clara separación de las bandas de histonas).
  7. Almacenar los nucleosomas a 4 ° C hasta su uso.
    Nota: Cuando se almacena en estas condiciones, los nucleosomas permanecen estables durante varios meses. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

2. funcionalización de la superficie de la Mica para la proyección de imagen estático AFM de nucleosomas

  1. Prepare una 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS solución en agua desionizada como se describe. Alícuotas de esta solución a 4 ° C hasta su uso en 30 tienda 1 mL.
    Nota: Las alícuotas pueden ser almacenadas durante más de un año a 4 ° C. 59
  2. Preparar una solución de 1:300 trabajo de APS para la modificación de mica disolviendo 50 μl de las acciones APS de 50 mM de 15 mL dd H2O.
    Nota: Esta solución de trabajo puede guardarse a temperatura ambiente durante varios días.
  3. Cortar tiras de 1 x 3 cm de mica de las hojas de mica de alta calidad (véase Tabla de materiales para mica usada aquí).
    1. Compruebe que la pieza se ajusta cuando se coloca diagonalmente en una cubeta. Utilice la punta de unas pinzas afiladas, una hoja de afeitar o cinta scotch, hender las capas de la mica hasta que ambos lados están recién troceados y la pieza es tan fina como ~0.1 mm (Figura 3A). Inmediatamente Coloque la pieza de mica en la cubeta llenadas de APS e incubar durante 30 min (figura 3B).
  4. Transferencia de la pieza de mica a una cubeta llenada de dd H2O y empápela por 30 s (figura 3). Secar completamente ambos lados de la tira de APS-mica en un flujo de argón.
    Nota: Pueden utilizarse para ayudar absorbe agua desde el borde de la mica al secarse a un no tejido celulosa y poliéster cleanroom trapo (trapo recomendado detallado en materiales).
  5. Uso la franja seca de la mica es ahora para la preparación de la muestra. De lo contrario, guardar la pieza en una cubeta limpia y seca (figura 3D).
    Nota: Almacenamiento adicional en el vacío durante 1-2 h se recomienda cuando el ambiente es húmedo. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

3. preparación de muestras de nucleosoma en APS-Mica para la proyección de imagen estático AFM

  1. Aplique cinta adhesiva de doble cara para varios discos magnéticos y colocarlos al lado.
  2. Corte el sustrato APS-mica al tamaño deseado (cuadrados de 1 x 1 cm para el instrumento MM AFM usada aquí). Coloque las piezas en una caja de Petri limpia y mantener cubierto.
  3. Preparar tres diluciones de los nucleosomas montados (nucleosoma final concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.0 nM) usando un 0,22 μm filtrado búfer que contiene 10 mM HEPES pH 7,5 y 4 mM MgCl2.
    Nota: Para limitar la pérdida de los nucleosomas en la baja concentración final, las diluciones se deben hacer uno por uno, inmediatamente antes de la deposición en la APS-mica.
  4. 5-10 μl de la muestra diluida del nucleosoma de depósito en el centro de la pieza de APS-mica y dejar incubar durante dos minutos. Enjuague suavemente la muestra con 2-3 mL de dd H2O para quitar todos los componentes del tampón. Después de cada mL de ~0.5 de dd H2O utilizado, sacuda suavemente la mica para eliminar el agua sobrante.
    Nota: Se recomienda una jeringa desechable para este paso de lavado.
  5. Secar la muestra depositada bajo un ligero flujo de gas argón limpio.
    Nota: La muestra está lista para ser fotografiada o puede guardarse en un armario vacío o desecador lleno de argón. Muestras preparadas y almacenadas como se describe han sido reflejadas un año después de la preparación sin pérdida de calidad. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

4. proyección de imagen de AFM estática de los nucleosomas

  1. Coloque una punta AFM en el sostenedor de la extremidad. Utilice una punta que tiene una constante de resorte de ~ 40 N/m y una frecuencia de resonancia entre 340 y 300 kHz (véase la Tabla de materiales para las ménsulas utilizado aquí).
  2. Montaje de la muestra preparada en el apartado 3 en la etapa AFM teniendo cuidado de no entrar en contacto con la superficie de la muestra.
  3. Coloque el láser sobre el voladizo hasta que la suma es el máximo y ajuste los valores de la deflexión vertical y lateral para cerca de cero.
  4. Sintonizar la sonda AFM para encontrar su frecuencia de resonancia y ajustar la amplitud de la unidad y el tamaño de la imagen a 100 x 100 nm. Haga clic en el botón participar para iniciar el acercamiento.
  5. Una vez que se acercaba, poco a poco optimizar el valor de amplitud hasta que la superficie de la muestra se ve claramente. Aumentar el tamaño de exploración a 1 x 1 μm y la resolución a 512 x 512 píxeles. Haga clic en el botón de captura, seguido por el botón participar para comenzar la adquisición de la imagen.
    Nota: Las imágenes en la figura 4 muestran el fondo liso que se puede esperar cuando las muestras de la proyección de imagen.
  6. Para analizar la muestra del nucleosoma, abra las imágenes utilizando el software de análisis de instrumentos AFM.
    1. Aplanar la imagen mediante una resta de polinomio línea o similar.
    2. Establecer la tabla de colores para reflejar el valor más bajo para el mínimo y el valor más alto para el máximo. Mantener un registro de estos valores para cada imagen que necesitaban en un paso posterior.
      Nota: Si no se usan estos valores, datos de altura será incorrectos en el análisis posterior como cortes transversales de corazones nucleosoma aparecerá como mesetas de altura igual, en lugar de variables.
    3. Exportar la imagen como una imagen TIFF en el tamaño original. Anular la selección de las opciones para guardar la imagen con una escala o en bares.
    4. Abra la imagen en el software de análisis de las mediciones de la longitud del contorno.
    5. Configurar las x, y y z escalas para que coincida con la imagen.
    6. Una calibración de la longitud interna, mida y registre la longitud del contorno de ADN libre de un extremo a otro. Para este factor de calibración, uso de las mediciones para generar un histograma y ajuste con una distribución normal (gaussiana). Dividir el centro de pico (xc) por la longitud de sustrato en pares de bases.
      Nota: Este valor es el factor de conversión específico de imagen de nanómetros a pares base de ADN.
    7. Mida y registre la longitud del contorno de ambos brazos para cada nucleosoma del extremo libre del brazo hasta el centro de la base de la coherencia (figura 5A).
    8. Para cada núcleo del nucleosoma, recoge dos completo ancho de media valores máximos de (FWHM) de un par perpendicular de la base de medidas de sección transversal (figura 5B promedio de las dos medidas de FWHM y restar la mitad del valor resultante de cada brazo del nucleosoma correcto para la longitud medida desde la salida/entrada de ADN en el centro de la base no es parte de la longitud del brazo.
    9. Divida cada longitud del brazo por el factor de calibración calculado (paso 4.5.6) para obtener longitudes de brazo en pares de bases del ADN.
    10. Calcular la medida de la DNA de embalaje restando la suma de brazo de nucleosoma de la longitud total par de base del sustrato sin envolver. Trazar estos valores como un histograma y ajuste de la peak(s) con una distribución normal (Gaussianas) para obtener los media envuelto de pares de bases del ADN para la población de nucleosoma.
    11. Calcular la altura promedio del nucleosoma de las secciones transversales medidas. Esta parcela como un histograma y ajuste de la peak(s) con una distribución normal (Gaussianas) para obtener la altura de la población de nucleosoma.

5. proyección de imagen de AFM Time-lapse de la dinámica del nucleosoma

  1. Montaje de la punta AFM en el sostenedor de la extremidad. Puede utilizar una sonda con una constante de resorte de aproximadamente 0.1 N/m y una frecuencia de resonancia de 7 a 10 kHz (véase la lista de materiales para las ménsulas utilizado aquí).
  2. Póngale un trozo de 1 x 1 cm de APS-mica en un disco magnético con cinta de pegar y montar el disco en el instrumento de la AFM.
  3. Diluir los nucleosomas a una concentración de nM 1 en un búfer de imagen filtrada de 0,22 μm que contiene 10 mM HEPES pH 7,5 y 4 mM MgCl2.
  4. Depósito 5-10 μl del nucleosoma diluido en el centro de la pieza de mica para 2 minutos enjuague la muestra depositada con 20μL del buffer de imagen dos veces. Después el segundo enjuague, mantenga una gota de tampón sobre la superficie de la proyección de imagen.
  5. Utilice la cámara vista superior para encontrar la punta y el acercamiento a la superficie manualmente hasta que la punta es ~ 100-500 μm de la superficie.
  6. Añadir el buffer de imagen adicional para llenar la brecha entre la punta y la superficie. En este ejemplo, aproximadamente 50 μl de tampón de la proyección de imagen es suficiente para llenar la brecha. Encuentra un pico de resonancia de la punta.
  7. Comenzar el enfoque controlado por el ordenador a la superficie. Cuando se acercó, comienza la proyección de imagen con un área de 1-2 μm para seleccionar un área de ~ 500 nm de interés. Con esta área de interés seleccionada, ajustar la densidad de adquisición de datos de 512 x 512 píxeles.
  8. Ajustar la tensión de punto de ajuste y parámetros de amplitud para mejorar la calidad de la imagen de unidad. Una amplitud libre de 10 nm o menos y una velocidad de lectura de ~ 2 Hz puede utilizarse para capturar imágenes de calidad. En la figura 6se muestra un ejemplo de la dinámica de nucleosoma con Time-lapse AFM.

6. proyección de imagen de AFM alta velocidad de Time-lapse de la dinámica del nucleosoma

Nota: El protocolo que a continuación se proporciona para el instrumento de AFM capítulo desarrollado por el grupo de Ando (Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón). 60

  1. Preparar APS-mica para la proyección de imagen de líquido.
    1. Coloque la varilla de vidrio en la etapa de escáner AFM utilizando la varilla de vidrio - pegamento de escáner (véase Tabla de materiales). Que esta seco por un mínimo de 10 minutos.
    2. Hacer ~0.1 gruesas piezas circulares mm de mica con un diámetro de 1,5 mm por perforación de una hoja más grande de la mica. Utilice el pegamento de barra de mica de vidrio capítulo-AFM (véase Tabla de materiales) para fijar esta pieza de mica a la varilla de vidrio en el HS-AFM y seco, sin tocar durante un mínimo de 10 minutos. Cleave capas utilizando una cinta sensible a la presión hasta que se vea una capa bien troceada en la cinta.
    3. Diluir 1 μl del stock APS 50 mM en 99 μl de dd H2O para hacer una solución APS 500 μm. Depósito de 2.5 μl de esta solución sobre la superficie recién descamada mica y permiten funcionalizar durante 30 minutos.
      Nota: Para evitar el secado de la superficie al tiempo que funcionales, la tapa de un tubo de centrífuga cónico de 50 mL se puede caber con un pedazo húmedo de papel de filtro y colocar sobre el escáner. Las acciones APS se diluyeron 3 veces menos líquido imagen que para la proyección de imagen estática para controlar la dinámica a una tasa que puede ser observada con AFM.
    4. Enjuague la mica con 20 μl de dd H2O mediante la aplicación de varios enjuagues de μl de ~ 3. Eliminar el agua completamente después de cada enjuague colocando un paño no tejido en el borde de la mica. Después del enjuague final, colocar ~ 3 μl de dd H2O en la superficie y dejar reposar un mínimo de 5 minutos para quitar cualquier APS hibridada.
  2. Coloque la sonda en el soporte HS-AFM y coloque el soporte en la etapa AFM con la punta hacia arriba. Enjuague el soporte con ~ 100 μl del dd H2O seguido por enjuagues dos ~ 100 μl de 0,22 μm filtrado los nucleosomas de búfer que contiene 10 mM HEPES pH 7,5 y 4 mM MgCl2.
  3. Con las aclaraciones que hacer, llenar la cámara con ~ 100 μl de buffer, sumergir la punta de la proyección de imagen del nucleosoma. Ajustar la posición de voladizo hasta que se golpea con el láser. Enjuague la APS-mica con 20 μl del filtrado nucleosoma buffer, la proyección de imagen usando ~ 4 μL por enjuague.
  4. Diluir 1 μl del stock conjunto nucleosoma en 250 μl del filtrado nucleosoma de buffer para una concentración final de nucleosoma de 1 nM. Depósito de 2.5 μl de esta dilución en la superficie y lo deje reposar por 2 minutos enjuagar la superficie con ~ 4 μL de nucleosoma buffer de imagen dos veces. Después del enjuague final, deja la superficie cubierta en búfer de imágenes.
    Nota: Si la superficie no se enjuaga después de depositar la muestra del nucleosoma, la superficie rápidamente se convierten en hacinamiento.
  5. Configurar el escáner y la muestra en la parte superior del sostenedor de la extremidad para que la muestra es cara abajo. Para comenzar el enfoque, utilice la función de auto enfoque con una amplitud del punto de ajuste, unas cerca de la oscilación libre amplitud A0.
    Nota: Idealmente, uns = 0,95 A0, sin embargo, en el 82% de0 funcionará tan bien si cuidado.
  6. Ajustar el punto fijo hasta que la superficie se rastrean bien.
    Nota: Para minimizar la transferencia de energía desde la punta AFM para la muestra del nucleosoma, la amplitud del voladizo debe mantenerse pequeña, con amplitudes tan bajas como 1 nm óptima.
  7. Establecer el área de la imagen alrededor de 150 x 150 nm a 200 x 200 nm con la velocidad de adquisición de datos de ~ 300 ms por marco de la proyección de imagen.
    Nota: Este tamaño de imagen es normalmente suficiente para capturar la dinámica de los nucleosomas varias simultáneamente. Una superficie menos poblada puede requerir cambios en estos parámetros. El framerate sugerido es suficiente para captar dinámicas de nucleosoma como looping, deslizamiento y desenvolver, entre otros (véase resultados de representante de la sección a continuación).

7. Análisis de la dinámica de nucleosoma con Time-lapse AFM

  1. Convertir las imágenes del tipo de datos capítulo AFM (ASD) para imágenes TIFF.
    1. Aplanar las imágenes utilizando el software de análisis del sistema AFM utilizando funciones ya sea en avión o en línea hasta que el fondo tiene contraste uniforme.
    2. El contraste de la imagen (escala de color) se establece en automático.
      Nota: El contraste se puede ajustar manualmente para fines de presentación, pero no para el análisis. Esto hace que detalle de altura para perderse en las imágenes convertidas.
    3. Guardar el rango seleccionado de imágenes como un archivo mov. Anule la selección de la barra de escala y opciones antes de guardar la frontera.
      Notas: No hace análisis de imágenes que tienen barras de escala en el marco. Estos alteran el tamaño de la imagen y dará como resultado mediciones falsas.
    4. Convertir el archivo .mov a imágenes tiff usando un software adecuado (véase Tabla de materiales). Utilizar la misma velocidad de fotogramas para la conversión como se utilizó al crear el archivo .mov.
  2. Para medidas contorno de brazo largo, abrir las imágenes en un software de medición capaz de medición de este tipo (véase Tabla de materiales).
    1. Establecer las dimensiones de la imagen para que coincidan con aquellos en que fue capturado.
    2. Medir la longitud del contorno de cada nucleosoma brazo desde el extremo del brazo al centro del núcleo del nucleosoma y registrar las mediciones en una hoja de cálculo (Figura 4A).
    3. Mida la longitud del sustrato de ADN envueltos en los marcos después de que desenvuelve un nucleosoma. Lo uso para una calibración específica del película de la relación de nm/bp que se utiliza para el nucleosoma que envuelve cálculos
    4. Recoger dos perfiles de sección transversal para el núcleo del nucleosoma y dos para el ADN desnudo (Figura 4B).
    5. Importar los perfiles de sección transversal a un software de hoja de cálculo y normalizar las parcelas restando el valor de z más bajo de todos los puntos del perfil.
    6. Calcular la altura y la anchura total a mitad de máximo (FWHM) para cada sección y promedio de los valores de los dos perfiles para cada fotograma.
  3. Reste la mitad del valor FWHM de cada nucleosoma brazos son parcela como un diagrama de dispersión junto con la suma calculada de los brazos.
    1. Calcular la longitud del contorno promedio de las mediciones de ADN efectuadas para el ADN en los marcos después de que el nucleosoma no embolsados.
    2. Determinar el factor de calibración nm/bp dividiendo la media longitud del contorno de la DNA libre por la longitud del par de base del sustrato de ADN. Utilice este valor para calcular la envoltura nucleosoma en cada fotograma, como se describe en la sección 5.12.

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Resultados

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Mono-nucleosomas primero se prepararon para AFM imágenes experimentos utilizando un método de montaje de dilución continua (figura 1). Entonces se verificaron los nucleosomas preparados mediante SDS-PAGE discontinuo (figura 2). Una superficie de mica fue a continuación funcionalizada con APS, que captura los nucleosomas en la superficie manteniendo un fondo liso para la proyección de imagen de alta resolución (figura 3). Nucleosomas...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito anteriormente es algo sencillo y proporcionan resultados altamente reproducibles, aunque algunos problemas se pueden acentuar. APS-mica funcionalizada es un sustrato clave para obtener resultados confiables y reproducibles. Una alta estabilidad de APS-mica es una de las características importantes de este sustrato que permite preparar el sustrato imágenes por adelantado para el uso que se puede utilizar al menos dos semanas después de ser preparado. 59 ,

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Las contribuciones del autor: AVP y MSD diseñan el proyecto; MSD montar nucleosomas. MSD y ZS realizaron análisis de experimentos y datos AFM. Todos los autores escribieron y editó el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plásmido pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
Imprimaciones de PCRIDT, Coralville, IAPedido personalizado(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerasaThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificación de PCRQiagen, Hilden, Alemania 28104Número de catálogo para 50 unidades
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Número de catálogo para EDTA de 250 g
ThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, EpiCypher humano recombinante, Durham, NC16-0010 Número decatálogo para 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher humano recombinante, Durham, NC15-0311 Número decatálogo para
Octamer H3 de 50 ug, EpiCypher humano recombinante, Durham, NC16-0001Número de catálogo para
Slide-A-Lyzer MINI Kit de dispositivo de diálisis de 50 ug, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Número de catálogo para 10 dispositivos
Cloruro de sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500G Número decatálogo para 500 mg
Amicon Ultra-0.5  Filtros centrífugos mL Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Número de catálogo para 8 dispositivos
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNúmero de catálogo para 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25G Número decatálogo para SDS de 25 g
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Número de catálogo para 1 kg
persulfato de amonio (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Número de catálogo para 10 g
solución de acrilamida/Bis al 30%, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Número de catálogo para 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Número de catálogo para 5 mL
4 tampones de muestra de proteína Laemmli para SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Número de catálogo para 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLNúmero de catálogo para 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Número de catálogo para 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Número de catálogo para
toallitas no tejidas para salas limpias de 1 L: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Bloque de moscovita MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrado 1
Aminopropil silatrano (APS)Sintetizado como se describe en 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25G Número decatálogo para cinta adhesiva escocesa de 25 g
Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda AFM TESPA-V2 (para imágenes estáticas)Sondas AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonda AFM MSNL-10 (para imaing de lapso de tiempo estándar)Sondas AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Número de catálogo para tubo de 2 g
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100G Número decatálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0.22  y micro; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Número de catálogo para 10 dispositivos
BL-AC10DS-A2 sonda afm (para HS-AFM)Olympus, Japón
Compuesto FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón  
Compuesto FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón  
Microscopio de fuerza atómica multimodoBruker-Nano/Veeco, Santa Bárbara, CA
Microscopía de fuerza atómica de lapso de tiempo de alta velocidadToshio Ando, Instituto de Ciencias de la Nano-Vida, Universidad de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japón
de de

Referencias

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