Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar partículas nucleosoma en el nivel de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica estática y Time-lapse (AFM) técnicas de imagen. El método de funcionalización de superficies descrito permite la captura de la estructura y la dinámica de los nucleosomas en alta resolución a escala nanométrica.

Abstract

La cromatina, que es una cadena larga de subunidades del nucleosoma, es un sistema dinámico que permite tales procesos críticos como la replicación del ADN y transcripción para tomar lugar en las células eucariotas. La dinámica de los nucleosomas proporciona acceso al ADN, por mecanismos de replicación y la transcripción y crítica contribuye a los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones de la cromatina. Una sola molécula estudios tales como microscopia de fuerza atómica (AFM) la proyección de imagen han contribuido significativamente a nuestra comprensión actual del papel de la estructura del nucleosoma y dinámica. El actual protocolo describe los pasos que permite técnicas de imagen AFM alta resolución estudiar las propiedades estructurales y dinámicas de los nucleosomas. El protocolo es ilustrado por datos AFM obtenidos para los nucleosomas centrómero en la cual las histonas H3 se sustituye por su proteína de centrómero homólogo (CENP-A). El protocolo comienza con el ensamblaje de los nucleosomas mono usando un método de dilución continua. La preparación del substrato de mica funcionalizado con silatrane de aminopropil (APS-mica) que se utiliza para la proyección de imagen de nucleosoma es crítica para la visualización de AFM de nucleosomas que se describe y se proporciona el procedimiento para preparar el sustrato. Nucleosomas depositados sobre la superficie de la mica de la APS son reflejados primero usando estático AFM, que captura una instantánea de la población de nucleosoma. Del análisis de estas imágenes, estos parámetros como el tamaño del ADN envuelto alrededor de los nucleosomas se pueden medir y también se detalla este proceso. La AFM Time-lapse de procedimiento en el líquido se describe para el AFM de alta velocidad Time-lapse que puede capturar varios marcos de la dinámica de nucleosoma por segundo. Por último, el análisis de la dinámica del nucleosoma que permite la caracterización cuantitativa de los procesos dinámicos es descrito e ilustrado.

Introduction

En las células eucariotas, el ADN es altamente condensada y organizado en cromosomas. ¹ el primer nivel de organización del ADN en un cromosoma es el conjunto de nucleosomas en que 147 PB de ADN se envuelve firmemente alrededor de un núcleo del octámero de histonas. ^{2 , 3} partículas nucleosoma montan en una larga molécula de ADN formando una matriz de cromatina que luego es organizada hasta que se forma una unidad muy compacta cromosoma. ⁴ el desmontaje de la cromatina proporciona el acceso para liberar ADN requerido por los procesos celulares críticos como gene ....

Protocol

1. continua dilución Asamblea de Mono-nucleosomas

1. Generar y purificar un sustrato de ADN aproximadamente 400 bp que contiene un nucleosoma de Widom 601 off centrado en la secuencia de posicionamiento. ⁵⁵
   Nota: Para limitar la formación indeseada de di-nucleosomas, cada 'brazo' que flanquean la secuencia de colocación no debe exceder 150 ~ bp.
   1. Usar el plásmido pGEM3Z-601 junto con los cebadores diseñados y amplificar el ADN substrato usando PCR. Para el substrato de bp 423 con 122 y 154 longitudes de brazo bp utilizado aquí, utilice hacia adelante (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') y reversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') cartillas....

Results

Mono-nucleosomas primero se prepararon para AFM imágenes experimentos utilizando un método de montaje de dilución continua (figura 1). Entonces se verificaron los nucleosomas preparados mediante SDS-PAGE discontinuo (figura 2). Una superficie de mica fue a continuación funcionalizada con APS, que captura los nucleosomas en la superficie manteniendo un fondo liso para la proyección de imagen de alta resolución (figura 3). Nucleosomas.......

Discussion

El protocolo descrito anteriormente es algo sencillo y proporcionan resultados altamente reproducibles, aunque algunos problemas se pueden acentuar. APS-mica funcionalizada es un sustrato clave para obtener resultados confiables y reproducibles. Una alta estabilidad de APS-mica es una de las características importantes de este sustrato que permite preparar el sustrato imágenes por adelantado para el uso que se puede utilizar al menos dos semanas después de ser preparado. ^{59 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plásmido pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
Imprimaciones de PCR	IDT, Coralville, IA	Pedido personalizado	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerasa	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificación de PCR	Qiagen, Hilden, Alemania	28104	Número de catálogo para 50 unidades
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Número de catálogo para EDTA de 250 g
	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, EpiCypher humano recombinante	, Durham, NC	16-0010 Número de	catálogo para 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher humano recombinante	, Durham, NC	15-0311 Número de	catálogo para
Octamer H3 de 50 ug, EpiCypher humano recombinante	, Durham, NC	16-0001	Número de catálogo para
Slide-A-Lyzer MINI Kit de dispositivo de diálisis de 50 ug, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G Número de	catálogo para 500 mg
Amicon Ultra-0.5  Filtros centrífugos mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G Número de	catálogo para SDS de 25 g
	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
persulfato de amonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Número de catálogo para 10 g
solución de acrilamida/Bis al 30%, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Número de catálogo para 5 mL
4 tampones de muestra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número de catálogo para 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Número de catálogo para 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Número de catálogo para
toallitas no tejidas para salas limpias de 1 L: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Bloque de moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado 1
Aminopropil silatrano (APS)	Sintetizado como se describe en 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G Número de	catálogo para cinta adhesiva escocesa de 25 g
	Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda AFM TESPA-V2 (para imágenes estáticas)	Sondas AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonda AFM MSNL-10 (para imaing de lapso de tiempo estándar)	Sondas AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Número de catálogo para tubo de 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G Número de	catálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0.22  y micro; m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
BL-AC10DS-A2 sonda afm (para HS-AFM)	Olympus, Japón
Compuesto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón
Compuesto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japón
Microscopio de fuerza atómica multimodo	Bruker-Nano/Veeco, Santa Bárbara, CA
Microscopía de fuerza atómica de lapso de tiempo de alta velocidad	Toshio Ando, Instituto de Ciencias de la Nano-Vida, Universidad de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japón