Análisis de la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del Rotavirus

Virus de ARN forman una población genéticamente diversa, conocida como quasispecies¹, debido a su tasa de mutación,² que es más alto que el de los organismos basada en ADN. Estructura de la población en quasispecies es afectada por los factores genéticos de la población, incluyendo la presión de selección, la mutación y la deriva genética. Las cepas dentro de un solo linaje genético pueden mostrar diferentes fenotipos debido a la diversidad genética. Por ejemplo, Rachmadi et al demostró que cloro libre sensibilidad fue diferente entre cepas de norovirus murino que se originaron de una cepa purificada placa S7-PP3³.

Rotavirus (rotavirus de género en la familia reoviridae) son virus no-envueltos ds RNA formando quasiespecies². Además de los factores genéticos de la población descritos, reordenamiento del genoma afecta la diversidad genética de rotavirus porque este virus tiene 11 genomas segmentados⁴. Rotavirus causan diarrea principalmente entre los neonatos, y las muertes infantiles en el 2013 se estimaron sobre 250.000⁵. Dos vacunas están en uso en varios países y han sido eficaces en la reducción de la carga de la infección por rotavirus, pero algunos investigadores ahora están discutiendo la presencia de vacuna-escape mutantes^{6,7,8, 9}. la caracterización de estos mutantes es importante comprender los mecanismos de escape de la vacuna.

Aquí, presentamos protocolos para dos ensayos para evaluar la tasa de crecimiento específico y la capacidad de unión a la célula del rotavirus para entender las diferencias fenotípicas entre cepas/mutantes. La curva de crecimiento de los rotavirus ha sido presentada en anteriores informes¹⁰, pero no se miden usualmente los parámetros de crecimiento tales como la tasa de crecimiento específico. Un ensayo de unión a la célula llevado a cabo anteriormente consiste en la tinción inmunofluorescente de técnica¹¹. Aquí mostramos los métodos más fácil de utilizar el ensayo de placa y RT-qPCR, que permiten analizar cuantitativamente la diferencia de fenotipos virales. Estos métodos son apropiados para la caracterización de fenotipos de rotavirus y finalmente pueden contribuir a la construcción de nuevas vacunas eficaces para varios genotipos.

1. medio preparación

1. Para hacer un medio de cultivo celular (medio que contiene el suero), añadir 4,7 g de MEM polvo Eagle en 500 mL de agua destilada. Autoclave a 120 ° C por 20 min y dejar que el medio se enfríe a temperatura ambiente. Añadir suero bovino fetal (concentración final: 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina estreptomicina (1%) y bicarbonato de sodio (1,125 g/L). Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
2. Preparar el medio libre de suero para la propagación de virus como se describe en el paso 1.1, pero sin el suero bovino fetal. Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
3. Para el ensayo de placa, esterilice en autoclave los 100 mL de medio MEM del águila (no contiene rojo de fenol). Que el medio fresco a temperatura ambiente y luego agregar 2% SFB, 2% penicilina estreptomicina, 4 mM L-glutamina y 2,25 g/L de NaHCO₃. Almacenar a 4 ° C.
4. Para el ensayo de placa, esterilizar 100 mL de gel de agarosa al 2,5% por autoclave. Preparar el gel el mismo día que se lleva a cabo el ensayo de placa. Guarde el gel a 47 ° C en un baño de agua.

2. cultivo celular

1. Quitar un criotubo que contiene líneas de células MA104 del contenedor de nitrógeno líquido. Coloque el criotubo en un baño de agua a 37 ° C para las células. Añadir 1 mL de la suspensión de células a 20 mL del medio que contiene el suero en un matraz T75. Incube el frasco en una incubadora a 37 ° C y 5% CO₂ para 2 o 3 días.
   Nota: La concentración final de células en la suspensión es alrededor de 10⁶ células/mL.
2. Una vez que la monocapa celular alcanza el 80% de confluencia, quite el sobrenadante y se lavan las células dos veces con 5 mL de 1 x PBS de Dulbecco (tamponada fosfato salino).
3. Añadir 4 mL de tripsina 0,05%-EDTA al matraz e incubar a 37 ° C durante 5 min separar las células del frasco. Transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL y centrifugar a 190 x g durante 5 minutos.
4. Desechar el sobrenadante y resuspender el peletizado células (10⁶ ) en 1 mL de 1.1 preparados en medio que contiene el suero. Diluir las células resuspendidas en 100-fold con el medio.
5. Añadir 3 mL de la suspensión diluida de células a cada pozo de 6 pozos (para el ensayo de placa) o placas de 24 pozos (para el ensayo de unión a la célula), respectivamente. Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado durante 2 o 3 días.
   Nota: Un matraz T75 es adecuado para recoger las muestras del curso del tiempo, porque el volumen de muestra del sobrenadante (1 mL) puede ser ignorado en comparación con el volumen de sobrenadante total (30 mL). Mientras tanto, el título infeccioso del virus en cada sobrenadante se mide por el ensayo de placa, que generalmente se realiza mediante una placa de 6 pozos. Una placa de 24 pozos se utiliza para el ensayo de unión a la célula.

3. tasa de crecimiento específico de Rotavirus

Nota: Rotavirus de rhesus (RRV, genotipo: G3P[3]) se utiliza en este protocolo porque RRV puede rápidamente y fácilmente forman placas con células MA104.

1. Coloque un tubo que contenga 1 mL de la suspensión de virus (10⁷ pfu/mL) en un medio libre de suero almacenada a-80 ° C en un baño de agua a 37 ° C para descongelar. Añadir 1 μg/μl tripsina del páncreas porcino 1 ml de la suspensión de virus (concentración de tripsina final es 4 μg/mL) y luego el vórtice. Incubar la suspensión de virus a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado durante 30 minutos.
   Nota: Tripsina de otras fuentes puede ser utilizado, pero el efecto sobre la infectividad del rotavirus debe probarse de antemano.
2. Diluir la suspensión de virus activado con un medio libre de suero para ajustar la multiplicidad de infección (MOI) a 0.1 UFP/célula.
3. Añadir 1 mL de la suspensión de virus diluido a líneas de células MA104 (80% confluente) en un matraz T75 3 días después de la celda (2,1) de la galjanoplastia, incubar a 37 ° C durante 1 h y agite suavemente el frasco cada 15 minutos.
4. Luego, Añadir 30 mL de un medio libre de suero que contiene 0,13 μg/mL de tripsina de un páncreas porcino al matraz. Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado.
5. Recoger 1 mL del sobrenadante en el matraz a 0, 6, 12, 18, 24 y 36 (o 48) h post-infección (hpi) y vuelva a colocar el sobrenadante en los tubos de 1,5 mL con una pipeta.
6. Llevar a cabo la congelación (-80 ° C) y fundir en un baño de agua a 37 ° C ciclo tres veces. Luego centrifugar los tubos a 12.600 x g por 10 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante.
7. Filtrar el sobrenadante con un filtro de 0.2 μm destilada para remover la fracción de la célula. Guarde el sobrenadante-80 ° C en el refrigerador hasta aplicar el ensayo de placa para medir la concentración de virus.
8. Colocar los tubos que contienen el sobrenadante recogido (paso 3.5) en baño de agua a 37 ° C. Añadir 4 tripsina μg/mL a 1 mL de muestra diluida 10 veces e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
9. Durante la incubación de 30 min en 3.8, para comenzar el ensayo de placa para medir la concentración de virus obtenida de muestras del curso de tiempo (paso 3.5), se lavan las células MA104 dos veces en una placa de 6 pozos con 2 mL de 1 x PBS después de retirar el medio que contiene el suero.
10. En serie Diluya las muestras incubadas con un medio libre de suero e inocular 1 mL de la muestra diluida en cada pocillo. Incube la placa durante 90 minutos a 37 ° C y 5% CO₂ en el vapor saturado y agitar suavemente la placa cada 15 minutos.
11. Después de la incubación, retirar el inóculo de la placa de 6 pozos. Añadir 4 tripsina μg/mL al medio preparado (paso 1.3). Suavemente pero inmediatamente Agregue 3 mL del medio mezclado con gel de agarosa (la proporción es 1:1) a cada pocillo.
12. Mantener la placa a temperatura ambiente durante más de 10 minutos (hasta que el gel de agarosa se convierte en sólido) e incubar durante 2 días a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado.
    Nota: Vierta el medio mezclado con agar desde el borde del pozo.
13. Añadir 1 mL de la solución de rojo neutro de 0.015% diluida con 1 x PBS a cada pocillo e incubar a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado. Quitar el tinte después de 3 horas e incubar durante 1 día a 37 ° C y 5% de CO₂ en el vapor saturado.
14. Al día siguiente, contar el número de placas en cada pozo y calcular la pfu/mL. Revise cuidadosamente la confluencia celular antes del ensayo de placa para asegurar al número de placa.

4. Unión a célula de ensayo

Nota: Este protocolo se basa en informe^{13 de Gilling}.

1. Añadir 1 μg/μl tripsina de un páncreas porcino 1 ml de la suspensión de virus (concentración de tripsina final es 4 μg/mL) y luego el vórtice (de la misma manera como en 2.1). Diluir la suspensión de virus con un medio libre de suero para ajustar el MOI de 1 UFP/célula.
2. Luego, lavar las células MA104 dos veces en placa de 24 pozos con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L de NaCl, KCl, de 0,3 g/L 0,046 g/l de Na₂HPO₄ para llegar a 1 L con agua destilada).
3. Sembrar 100 μl de suspensión de virus diluido en cada pocillo de una placa de 24 pocillos con células e incubar a 4 ° C por 90 min, con agitación suave cada 15 minutos.
4. Eliminar el inóculo de virus y se lavan las células dos veces con 1 mL de TBS. Para extraer el bicatenario (ds) RNA de los rotavirus, añadir 140 μl de 1 x PBS y 560 μl del buffer de extracción de RNA (véase Tabla de materiales) a cada pocillo. Mezcle adecuadamente con una pipeta (sobre x 10 o hasta que la bruma o contaminante de las células en el buffer no se ve).
5. Después de recuperar el RNA trenzado doble (dsRNA) según protocolo del fabricante, coloque los tubos de 1.5 mL que contiene el extracto dsRNA en un bloque térmico a 95 ° C por 5 min desnaturalizar el dsRNA, inmediatamente Coloque los tubos en hielo e incube durante más de 2 min.
6. Sintetizar el cDNA usando una transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales). Añadir 4 μL de la solución de RNA viral desnaturalizada a un tubo PCR que contiene 16 μl de mezcla (tabla 1) y mezclar cuidadosamente con una pipeta para no generar burbujas. Desactivación de los tubos.
7. Realizar la transcripción inversa con un termociclador bajo condición que se muestra en la tabla 2. Si el cDNA no se utiliza inmediatamente, guarde el tubo PCR que contiene el cDNA a-20 ° C hasta por 1 año.
8. Utilizar los cebadores para la PCR cuantitativa (Forward 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', inversa; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ y una sonda de inserción de un quencher (qPCR sondas; 5'- / FAM/ATGAGCACA/extintor/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), dirigida a la 963 – 1049 región de NSP3 segmentos de genoma de rotavirus (cepa ST3, GenBank: X81436).
   Nota: Quencher se inserta en la punta de prueba diseñado por Zeng et al.¹⁴
9. Diluir el plásmido estándar en serie (10¹ a 10⁶ copias/mL) con PCR grado agua a la mezcla de qPCR (tabla 3) y hacer la mezcla principal (20 μl/muestra) para qPCR siguiente tabla 4.
10. Añadir 20 μl de la mezcla principal al pozo de una placa PCR de 96 pocillos y luego mezcle 5 μl de las muestras de cDNA o 5 μl del plásmido estándar mediante pipeteo 10 veces. Iniciar la reacción del sistema qPCR según las condiciones que se muestra en la tabla 4.
11. Para calcular el genoma de rotavirus a la superficie de las células MA104, realizar regresión lineal entre los valores de Ct y el número de genoma conocido de un plásmido estándar y estimar el número de genoma. Luego calcular la razón de atascamiento de números de virión células (G_t) que en el inóculo inicial (G₀).

Un resumen de dos protocolos para la tasa de crecimiento y ensayo de unión a la célula de placa purificada RRV variedades se muestra en la figura 1A y 2A, respectivamente.

En el análisis de la tasa de crecimiento específico, el título final de virus alcanza más de 107 pfu/mL cuando propagar en el matraz T75. Si la máxima concentración es menor que7 10 pfu/mL, las células MA104 no pueden ser confluentes o RRV no fue activada por tripsina. Algunos modelos de crecimiento están disponibles para estimar la tasa de crecimiento específico, utilizando los datos de la unidad infecciosas. En el presente Protocolo, el de modelo de Gompertz modificado12 se emplea como ejemplo;

donde N0 (10 a4 pfu/mL en este estudio) y Nt (104 a8 10 pfu/mL) son el título infeccioso del virus (pfu/mL) en 0 y t (ejemplo: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivamente, A es el valor asintótico [log (N∞/N0 )] (ejemplo: 3 a 4), μ es la tasa de crecimiento específico [1/h], e es la constante de Napier y λ es el período de retraso [h]. Parámetros del modelo se obtienen mediante la función solver del software de análisis, que minimiza la suma de cuadrados de la diferencia entre los valores observados y modelados. En el ejemplo en la figura 1B, la tasa de crecimiento específico (μ) se estima 0.197 [1/h] y el periodo de desfase (λ) es 6.61 [h] aplicando el método menos cuadrado para un modelo de Gompertz modificado y la concentración relativa de virus en la fase estacionaria a la inicial del título ( registrar escala) (A) es 3.15 [log (N∞/n0)]. Hemos probado 6 clones de rotavirus en total, y los valores estimados de la tasa de crecimiento específico oscilan entre 0.19 y 0.27 [1/h]. Estos estimados valores son confiables debido a que el coeficiente de los valores de determinación en el ajuste del modelo es más de 0.98.

Viriones RRV vinculantes a las superficies de células fueron unos 103 copias/mL (enlace eficiencia rondaba el 1%) cuando se utiliza una placa de 24 pocillos para el ensayo de unión a la célula (figura 2B). El ensayo se realiza tres veces para cada muestra, y si se observa una gran variación en el número de copia en una muestra, pueden producirse algunos problemas tales como exceso de lavado e insuficiente activación de RRV por tripsina. El valor de Ct de qPCR superior a aproximadamente 36.0 no es preferible y se considera para estar debajo de un límite de detección en nuestra condición de qPCR.

Tabla 1: Master mix composición para síntesis de cDNA del genoma de rotavirus.

Tabla 2: Condición de reacción para la síntesis del cDNA del genoma de rotavirus.

Tabla 3: Master mix composición para PCR cuantitativa de un genoma de rotavirus.

Tabla 4: Condiciones de reacción para PCR cuantitativa de un genoma de rotavirus.

Figura 1: esquema Resumen de la estimación de crecimiento de rotavirus y la curva de crecimiento del rotavirus. (A) la unidad de infecciosa del rotavirus se mide con el ensayo de placa. (B) la curva (línea azul) es aproximada por el modelo de Gompertz modificado, basado en datos observados en nuestro laboratorio (círculo blanco). La tasa de crecimiento específico [μ]; 0.197 [h-1], período lag (λ); 6.61 [h], la concentración relativa de virus en la fase estacionaria a la concentración inicial (escala log) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen esquemático y representativo resultado el ensayo de unión a la célula de cinco cepas RRV purificados de placas en el laboratorio. (A) A placa de cultivo celular inoculada con rotavirus se incuba a 4 º C para inhibir la invasión de virus en las células. Después de la incubación y eliminando las partículas virales a las células, cuantificar el número de genomas procedentes de partículas virales enlazadas a la superficie de la célula con RT-qPCR. (B) el resultado de la Unión a célula ensayo aparecía como obligatoria la eficiencia (%), que era la proporción de partículas virales enlazadas a los presentes en el inóculo. Barra negrita: mediana, final de cajas: desviación cuartil, final de línea: máxima y mínima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.