Artículo de método

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

DOI:

10.3791/58830

⸱

30 de enero de 2019

 , 
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

En este artículo

Resumen

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Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.

Resumen

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Cuando están presentes en productos farmacéuticos, una endotoxina de componentes de pared celular bacteriana Gram-negativas (a menudo también llamada lipopolisacárido) puede causar inflamación, fiebre, hipo o hipertensión y, en casos extremos, puede conducir a daño de órganos y tejidos que pueden se convierten en fatales. Las cantidades de endotoxinas en productos farmacéuticos, por lo tanto, están estrictamente reguladas. Entre los métodos disponibles para detección de endotoxinas y cuantificación, el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) es de uso general en todo el mundo. Mientras que cualquier producto farmacéutico puede interferir con el ensayo LAL, nano-formulaciones representan un desafío particular debido a su complejidad. El objetivo de este trabajo es proporcionar a una guía práctica a los investigadores sin experiencia en la estimación de endotoxinas en la ingeniería de nanomateriales y nanopartículas formulado drogas. En este documento, se discuten recomendaciones prácticas para llevar a cabo análisis de gel-clot y tres formatos LAL como turbidez, cromogénico. Estos ensayos pueden utilizarse para determinar contaminación por endotoxinas en productos basados en nanotecnología, vacunas y adyuvantes.

Introducción

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Una endotoxina es un componente de la pared celular bacteriana Gram-negativos1,2. Puede activar las células inmunes en muy bajas concentraciones de (picogramo)1,2. Los mediadores proinflamatorios (citoquinas, leucotrienos, eicosanoides, etc.) producidos por las células en respuesta a una endotoxina son responsables de la fiebre, hipotensión, hipertensión y problemas de salud más severos incluyendo falta múltiple del órgano 1 , 2 , 3. la severidad de l....

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Protocolo

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1. preparación de muestras de nanopartículas

  1. Preparar la muestra de estudio en LAL agua de calidad.
  2. Si el pH de la muestra está fuera del rango de 6-8, ajustar el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio libre de pirógenos.
  3. LAL agua grado preparar varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no supera la máxima dilución válida (MVD). Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la estimación del Ministerio del interior.

2. preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

  1. Diluir la acción concentrada de hidróxido sódico con pirógenos LAL....

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Resultados

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El ejemplo de los datos generados después de probar esta formulación en ensayos LAL se muestra en la tabla 1. Doxorrubicina liposomal pegilada interfirió con LAL cromogénico en dilución 5. Sin embargo, esta interferencia fue superada por diluciones mayores. Recuperación de pico fue entre 50 y 200% cuando esta fórmula fue probada en diluciones 50 y 500 en turbidez y LAL cromogénico, así como en la dilución 5 en turbidez LAL. Ajustado por el factor de dilución, los resultad.......

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Discusión

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La información proporcionada en este protocolo se ha descrito antes15,26 y se basa en varios documentos normativos publicados por el US Food y Drug Administration (FDA o FDA) y farmacopea de Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27y también está disponible en el sitio web NCL20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El estudio fue apoyado por fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud, bajo contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de salud y servicios humanos, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
turbidez LAL < / hidróxido >de
muestra para que esté entre 6-8
LAL ReactivoAsociados de Cape CodT0051Este reactivo se puede utilizar con turbidez solo ensayo
Endotoxina de control Asociadosestándar de Cape CodE0005Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y coágulos de gel
Asociados de agua de grado LALde Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato de LAL
Tampón Glucashield Asociadosde Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Estos tubos se pueden utilizar con ensayos de turbidez y cromogenia
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1,0 mLRAININPPT25, Laspuntas y pipetas PPT10 pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
Cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Cde cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Lector FlexAssociates of Cape CodPKF96Se pueden utilizar otros instrumentos. Sin embargo, los reactivos de LAL y los estándares de endotoxinas utilizados en este ensayo pueden requerir optimización. Cuando se utilice otro instrumento, consulte a los fabricantes del instrumento y del kit de LAL para obtener instrucciones
fuertecromo <
pirocromo fuerte LALasociados de Cape CodCG1500-5Este reactivo es específico para el
estándar de endotoxinas de controlCape CodEC010Este estándar es diferente al utilizado para los LAL de turbidez y coágulos de gel; Está optimizado para un rendimiento óptimo en el ensayo cromogénico
Hidróxido de sodioSigmaS2770Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Ácido clorhídricoSigmaH9892Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Agua de grado LALAsociados de Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón GlucashieldAsociados de Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Estos tubos se pueden utilizar con ensayos
de turbidez y cromogénicosPuntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1,0 mlRAININPPT25, PPT10Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
Cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Cde cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Lector FlexAssociates of Cape CodPKF96Se pueden utilizar otros instrumentos. Sin embargo, los reactivos de LAL y los estándares de endotoxinas utilizados en este ensayo pueden requerir optimización. Cuando se utilice otro instrumento, consulte a los fabricantes de instrumentos y kits de LAL para obtener instrucciones
gel-coágulo fuerte
coágulo
de gel Control EndotoxinStandard Associates de Cape CodE0005Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y de coágulo de gel
Hidróxido de sodioSigmaS2770Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Ácido clorhídricoSigmaH9892Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Agua de grado LALAsociados de Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón GlucashieldAsociados de Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 10 x 75 mmAssociates of Cape CodTS050Estos tubos son para usar con el ensayo de gel-coágulo
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1 mLRAININPPT25, PPT10Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Ccualquier marcase puede usar
Baño de agua, 37 Ccualquier marcaSe puede usar cualquier marca, sin embargo, es importante apagar la circulación del agua o usar un baño de agua no circular porque el flujo de agua afectará la formación de coágulos y dará lugar a resultados falsos negativos
sodio fuerte Sigma S2770 Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8 Ácido clorhídrico Sigma H9892 Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la Se Se / reactivo >de de ensayo cromogénico de Se Se LAL fuerte Asociados de Cape Cod G5003 Este reactivo es específico para el ensayo de Se Se

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E.

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