Artículo de método

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

DOI:

10.3791/58830

⸱

30 de enero de 2019

 , 
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

En este artículo

Resumen

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Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuando están presentes en productos farmacéuticos, una endotoxina de componentes de pared celular bacteriana Gram-negativas (a menudo también llamada lipopolisacárido) puede causar inflamación, fiebre, hipo o hipertensión y, en casos extremos, puede conducir a daño de órganos y tejidos que pueden se convierten en fatales. Las cantidades de endotoxinas en productos farmacéuticos, por lo tanto, están estrictamente reguladas. Entre los métodos disponibles para detección de endotoxinas y cuantificación, el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) es de uso general en todo el mundo. Mientras que cualquier producto farmacéutico puede interferir con el ensayo LAL, nano-formulaciones representan un desafío particular debido a su complejidad. El objetivo de este trabajo es proporcionar a una guía práctica a los investigadores sin experiencia en la estimación de endotoxinas en la ingeniería de nanomateriales y nanopartículas formulado drogas. En este documento, se discuten recomendaciones prácticas para llevar a cabo análisis de gel-clot y tres formatos LAL como turbidez, cromogénico. Estos ensayos pueden utilizarse para determinar contaminación por endotoxinas en productos basados en nanotecnología, vacunas y adyuvantes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una endotoxina es un componente de la pared celular bacteriana Gram-negativos1,2. Puede activar las células inmunes en muy bajas concentraciones de (picogramo)1,2. Los mediadores proinflamatorios (citoquinas, leucotrienos, eicosanoides, etc.) producidos por las células en respuesta a una endotoxina son responsables de la fiebre, hipotensión, hipertensión y problemas de salud más severos incluyendo falta múltiple del órgano 1 , 2 , 3. la severidad de las mediada inmune efectos secundarios provocados por la endotoxina depende de su potencia determinada por la composición de la endotoxina y estructura y medida en unidades de endotoxina Internacional (IUs o EUs)3. El número de estas unidades por kilogramo de peso corporal se utiliza para establecer una dosis de umbral pirogénico de la endotoxina. Esta dosis es de que 5 EU/kg para productos farmacéuticos administrados vía todas las rutas pero la ruta intratecal. Medicamentos dosis por metro cuadrado de superficie del cuerpo, líquidos intraoculares, radiofármacos y productos administrados vía intratecal ruta tienen una dosis de pirógenos diferente umbral, que es de 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (donde V es la volumen del producto destinado a la administración) y 0,2 EU/kg, respectivamente4. Más detalles sobre la dosis pirogénica de umbral para varios medicamentos y dispositivos se proporcionan y discuten en otra parte4,5,6.

Animales varían ampliamente en su sensibilidad a las reacciones mediadas por endotoxinas. Los seres humanos, primates no humanos y conejos están entre las especies más extremadamente sensibles a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxinas efectos secundarios en los pacientes y evitar conclusiones inexactas de toxicidad preclínica y estudios de eficacia, es esencial para detectar y cuantificar endotoxinas en ambas formulaciones de grado clínico y preclínico exactamente. Varios métodos disponibles en la actualidad pueden lograr esta tarea. Uno de ellos es el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que se utiliza comúnmente en todo el mundo para productos biomédicos de la pantalla de la posible contaminación de endotoxina, así como para detectar infecciones bacterianas7,8,9. El lisado se prepara de amoebocytes, las células presentan en la sangre de los cangrejos de herradura Limulus polyphemus que residen en la costa este del continente de América del norte7. Interesante, hay algunas especies de cangrejos herradura (Tachypleus gigas y Tachypleus tridentatus) en Asia10. El lisado de Amoebocyte lysate (TAL) se utiliza en varios países asiáticos para la detección de endotoxina similar a cómo la LAL se utiliza en otros libres10. Los lisados (LAL y TAL) contienen un grupo de proteínas que al activarse le confieren actividad proteasa. Una de estas proteínas, el denominado Factor C se activa al contacto con la endotoxina. C Factor activado hiende Factor B, que a su vez también se convierte en una proteasa y hiende una enzima de coagulación pro para producir una coagulación enzimática. El resultado de esta cadena de reacciones es la formación de un gel, un aumento en la turbidez de la muestra y, en presencia de un sustrato cromogénico, la aparición de un producto coloreado, que sirven como base para gel-clot, turbiedad y ensayos cromogénicos, respectivamente. Aunque no existe ningún formato obligatorio de LAL, la US Food y Drug Administration (FDA) explica en la guía para documento de industria, que en caso de discrepancia en los resultados entre distintos formatos LAL, se tomó la decisión basado en el ensayo de gel-clot5 .

Muchos productos químicos de laboratorio de uso general (por ej., EDTA) y ensayos de drogas conocidos productos (p. ej., penicilina) interfieran con LAL11. La interferencia se suele identificar mediante la evaluación de la recuperación de la endotoxina estándar con una concentración conocida en una solución que contiene el material de prueba. Si la recuperación del punto es inferior al 50% o más del 200%, entonces el resultado de la LAL Ensayo para el material de prueba dada no es válido debido a la inhibición o aumento, respectivamente4. Formulaciones en base a nanotecnología son a menudo complejas e interfieren con la LAL a través de una variedad de mecanismos12,13,14. Se han descrito muchos enfoques para superar la interferencia: reconstitución de la muestra en los amortiguadores específicos y los tensioactivos, inactivación de la proteína por calefacción, destrucción de materiales huecos de lípidos por calentamiento y que complementa la muestra con exceso cationes divalentes5,12,13,14,15. También se han descrito métodos alternativos para situaciones cuando interferencia de LAL no puede superarse: ELISA, una célula de HEK-TLR4 reportero línea de ensayo y espectrometría de masas16,17,18, 19.

En este documento, se describen procedimientos experimentales para la realización de gel-clot, turbiedad y ensayos LAL cromogénicos. Estos ensayos también están disponibles en el laboratorio de caracterización de nanotecnología (NCL) Página Web20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (LAL gel-clot) y STE1.4 (LAL cromogénico). Se recomienda realizar al menos dos formatos diferentes para caracterizar la misma formulación de nano. Cuando no está de acuerdo resultados de la turbidez y el LAL cromogénico, los resultados de gel-clot se consideran5. Cuando no está de acuerdo resultados de los dos formatos LAL, adicional los resultados de estudios mediante test de activación de monocitos (MAT) o prueba de pirógenos de conejo (RPT) para verificar LAL son llevado a cabo21. Es importante tener en cuenta que cada método utilizado para la detección de endotoxina y evaluación pirógenos tiene ventajas y limitaciones21,22,23,24. Reconociendo las limitaciones del procedimiento utilizado para caracterizar una formulación determinada nanotecnología es esencial para obtener la justificación científica para el uso del procedimiento óptimo para nano-formulación.

En este estudio, doxorrubicina liposomal pegilada se utilizó como una formulación de nanopartículas de modelo. Esta formulación ha sido aprobada por la FDA en 1995 y utilizado para el tratamiento de pacientes de cáncer en todo el mundo25.

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Protocolo

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1. preparación de muestras de nanopartículas

  1. Preparar la muestra de estudio en LAL agua de calidad.
  2. Si el pH de la muestra está fuera del rango de 6-8, ajustar el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio libre de pirógenos.
  3. LAL agua grado preparar varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no supera la máxima dilución válida (MVD). Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la estimación del Ministerio del interior.

2. preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

  1. Diluir la acción concentrada de hidróxido sódico con pirógenos LAL reactivo agua para preparar una solución de trabajo a una concentración de 0.1 N.
  2. Diluir la acción del ácido clorhídrico concentrado utilizando agua de reactivo LAL pirógenos y preparar una solución de trabajo a una concentración final de 0.1 N.
  3. Preparación de la endotoxina estándar de Control (CSE)
    1. Reconstituir el CSE según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para notas importantes con respecto a la información proporcionada en el certificado. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de CSE en diferentes formatos LAL.
  4. Preparación del reactivo LAL
    1. Reconstituir el reactivo LAL según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para detalles importantes con respecto a la preparación del reactivo LAL. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de reactivo LAL en diferente formato LAL.

3. turbidez ensayo LAL

  1. Preparación de los estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con un rango de concentración de 0,001 a 1 UE/mL.
    2. Primero Etiquete tubos y agregar 900 μL de LAL-grade del agua en cada tubo. Luego agregar 100 μL de 10 UE/mL solutionn para preparar el estándar de calibración con la concentración de 1EU/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar tres estándares de calibración baja. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de los controles de calidad
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar IEC con concentración de 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μl de la 1 solución de CSE UE/mL y 475 μl de los nanomateriales de prueba en una dilución dada.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Abra el software (Tabla de materiales) haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador.
    4. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Introduce la información del grupo de identificación y datos de prueba en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    5. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable.
    6. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que es apropiado para la turbiedad LAL por elegir el método de turbidez LAL.
    7. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    8. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir el control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    9. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    10. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    11. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.

4. cromogénico LAL

  1. Preparación de estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con una concentración de 1 UE/mL.
    2. 900 μl de agua de LAL-grado y 100 μl de la calibración EU/mL 1 estándar, preparar un segundo estándar de calibración a una concentración de 0.1 UE/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar estándares de calibración bajos dos. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de controles de calidad.
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μL de la 1 solución de la UE/mL CSE con 475 μL de nanomateriales de prueba.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 405 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Abra el software haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Escriba prueba de identificación y datos de información del grupo en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    4. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable. Elegir el instrumento.
    5. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    6. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    7. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    8. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    9. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.

5. gel-Clot LAL

Nota: Este análisis identifican la presencia de endotoxinas en la muestra basada en la observación visual y la detección de un coágulo en el tubo de reacción. A continuación se describen los pasos experimentales. Utilizar una hoja de banco para registrar los resultados. Esta hoja de banco no es obligatoria, y otras maneras de registrar los resultados del ensayo son también aceptables. Un ejemplo de una hoja de banco se encuentra en materiales suplementarios para la conveniencia del lector. Lambda (l) es la sensibilidad del ensayo de gel-clot y 0,03 UE/mL.

  1. Etiqueta de tantos tubos de reacción según sea necesario para acomodar al número de muestras analizadas de la prueba. Consulte la hoja de banco para obtener más información sobre el número de réplicas utilizados en el paso 1, paso 2 y paso 3 del ensayo.
  2. Alícuota 100 μL de agua, controles o prueba de muestra por tubo.
  3. Preparar CSE tal que la concentración final es igual a 4λ.
  4. Mezclar 100 μL de la norma mencionada con 100 μL de muestra de agua o prueba para alcanzar la concentración final de CSE de 2λ. Repetir tres veces más para lograr la lambda y lambda mitad y un cuarto lambda.
  5. Asegúrese de que la temperatura en el baño de agua es de 37 ° C.
  6. Añada 100 μL de lisado por el tubo de ensayo, vortex brevemente y colocar la gradilla con los tubos en baño María durante 1 hora.
  7. Invertir el tubo con un movimiento suave.
  8. Resultados registros manualmente mediante "+" (coágulo firme) o "-" (no coágulo o coágulo flojo) en la ficha del Banco.
  9. Proceder con el análisis según la USP apuesta 854; utilice la hoja de banco como material de apoyo

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Resultados

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El ejemplo de los datos generados después de probar esta formulación en ensayos LAL se muestra en la tabla 1. Doxorrubicina liposomal pegilada interfirió con LAL cromogénico en dilución 5. Sin embargo, esta interferencia fue superada por diluciones mayores. Recuperación de pico fue entre 50 y 200% cuando esta fórmula fue probada en diluciones 50 y 500 en turbidez y LAL cromogénico, así como en la dilución 5 en turbidez LAL. Ajustado por el factor de dilución, los resultad...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La información proporcionada en este protocolo se ha descrito antes15,26 y se basa en varios documentos normativos publicados por el US Food y Drug Administration (FDA o FDA) y farmacopea de Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27y también está disponible en el sitio web NCL20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue apoyado por fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud, bajo contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de salud y servicios humanos, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
turbidez LAL < / hidróxido >de
muestra para que esté entre 6-8
LAL ReactivoAsociados de Cape CodT0051Este reactivo se puede utilizar con turbidez solo ensayo
Endotoxina de control Asociadosestándar de Cape CodE0005Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y coágulos de gel
Asociados de agua de grado LALde Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato de LAL
Tampón Glucashield Asociadosde Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Estos tubos se pueden utilizar con ensayos de turbidez y cromogenia
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1,0 mLRAININPPT25, Laspuntas y pipetas PPT10 pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
Cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Cde cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Lector FlexAssociates of Cape CodPKF96Se pueden utilizar otros instrumentos. Sin embargo, los reactivos de LAL y los estándares de endotoxinas utilizados en este ensayo pueden requerir optimización. Cuando se utilice otro instrumento, consulte a los fabricantes del instrumento y del kit de LAL para obtener instrucciones
fuertecromo <
pirocromo fuerte LALasociados de Cape CodCG1500-5Este reactivo es específico para el
estándar de endotoxinas de controlCape CodEC010Este estándar es diferente al utilizado para los LAL de turbidez y coágulos de gel; Está optimizado para un rendimiento óptimo en el ensayo cromogénico
Hidróxido de sodioSigmaS2770Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Ácido clorhídricoSigmaH9892Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Agua de grado LALAsociados de Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón GlucashieldAsociados de Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100Estos tubos se pueden utilizar con ensayos
de turbidez y cromogénicosPuntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1,0 mlRAININPPT25, PPT10Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
Cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Cde cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Lector FlexAssociates of Cape CodPKF96Se pueden utilizar otros instrumentos. Sin embargo, los reactivos de LAL y los estándares de endotoxinas utilizados en este ensayo pueden requerir optimización. Cuando se utilice otro instrumento, consulte a los fabricantes de instrumentos y kits de LAL para obtener instrucciones
gel-coágulo fuerte
coágulo
de gel Control EndotoxinStandard Associates de Cape CodE0005Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y de coágulo de gel
Hidróxido de sodioSigmaS2770Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Ácido clorhídricoSigmaH9892Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8
Agua de grado LALAsociados de Cape CodWP0501Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón GlucashieldAsociados de Cape CodGB051-25Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 10 x 75 mmAssociates of Cape CodTS050Estos tubos son para usar con el ensayo de gel-coágulo
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1 mLRAININPPT25, PPT10Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se verificó y confirmó su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga libres de pirógenos, 2,0 mLEppendorf22600044Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas de tarifa de pirógeno, 5 mlde Eppendorf30089669pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repeticiónEppendorf4982000020pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo decualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 Ccualquier marcaSe puede usar
cualquier marca Vórticede cualquier marcaSe puede usar cualquier marca
Congelador, -20 Ccualquier marcase puede usar
Baño de agua, 37 Ccualquier marcaSe puede usar cualquier marca, sin embargo, es importante apagar la circulación del agua o usar un baño de agua no circular porque el flujo de agua afectará la formación de coágulos y dará lugar a resultados falsos negativos
sodio fuerte Sigma S2770 Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6-8 Ácido clorhídrico Sigma H9892 Cuando sea necesario, se utiliza para ajustar el pH de la Se Se / reactivo >de de ensayo cromogénico de Se Se LAL fuerte Asociados de Cape Cod G5003 Este reactivo es específico para el ensayo de Se Se

Referencias

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