Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Md A. Hakim; Erik J. Behringer

doi:10.3791/58832

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Artículo de método

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

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DOI:

10.3791/58832

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20 de enero de 2019

Md A. Hakim¹ , Erik J. Behringer¹

¹Department of Basic Sciences, Loma Linda University

En este artículo

Resumen

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Resumen

Arterias cerebrales y su respectiva microcirculación entregan oxígeno y nutrientes a la regulación del flujo cerebral por medio de sangre. Las células endoteliales de la línea el lumen de los vasos sanguíneos y cambios de mando en el diámetro vascular según sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas. Principales vías de señalización de endotelial dependientes de hiperpolarización del potencial de membrana (V_m) y el óxido nítrico normalmente funcionan en paralelo para mediar vasodilatación y consiguiente aumento de flujo sanguíneo. Aunque parte integrante de la coordinación de vasodilatación sobre varios milímetros de longitud vascular, componentes de hiperpolarización derivado de endotelio (EDH) han sido históricamente difíciles de medir. Estos componentes de EDH implica intracelular Ca^{2 +} [Ca^{2 +}] aumenta y la posterior activación de pequeñas e intermedias conductancia de Ca^{2 +}-activado K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canales.

Aquí, presentamos una ilustración simplificada del aislamiento de fresco endotelio de arterias cerebrales de ratón; medidas simultáneas de endotelial [Ca^{2 +}]y V_m con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente; y una superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos bajo condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Arterias cerebrales posteriores desde el círculo de Willis se quitan de la comunicación posterior y las arterias basilares. Digestión enzimática de segmentos arteriales cerebrales posteriores limpiados y posterior trituración facilita la eliminación de la adventicia, los nervios perivasculares y las células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrales arteriales endoteliales "tubos" entonces están asegurados bajo un microscopio y examinaron usando una cámara, tubo fotomultiplicador, y uno o dos electrómetros bajo superfusion continua. Colectivamente, este método puede medir simultáneamente cambios endoteliales [Ca^{2 +}] y V_m en localizaciones celulares discretos, además de separarse de la EDH a través de uniones comunicantes hasta distancias de milímetros a lo largo de la intacta endotelio. Este método se espera que un análisis de alto rendimiento de las funciones endoteliales cerebrales subyacen mecanismos de regulación de flujo de sangre en el cerebro normal y enferma.

Introducción

Flujo de sangre a través del cerebro está regulado por la coordinación de la vasodilatación cerebrales arterias y arteriolas en redes vasculares¹. Células endoteliales que recubren cambios de comando resistencia cerebral arterias de diámetro vascular cuando sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas¹^,²^,³. En particular, durante la hiperpolarización derivado de endotelio (conocido comúnmente como EDH), intracelular Ca^{2 +}([Ca^{2 +}]) y señalización eléctrica en células endoteliales vasodilatación co....