Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Resumen

Bicapas de lípidos proporcionan una plataforma experimental única para estudios funcionales de los canales iónicos, permitiendo el examen de las interacciones membrana-canal bajo membrana varias composiciones de lípidos. Entre ellos, la bicapa de la interfaz de gota ha ganado popularidad; sin embargo, el tamaño grande de la membrana impide la grabación de bajo ruido eléctrico. Hemos establecido un método de contacto burbuja bicapa (CBB) que combina los beneficios de la bicapa lipídica planar y métodos de la abrazadera del remiendo, como la capacidad para variar la composición de lípidos y de manipular a los mecánicos de la bicapa, respectivamente. Usando la configuración para los experimentos de patch-clamp convencionales, experimentos basados en el CBB se pueden fácilmente realizar. En Resumen, la solución de un electrolito en una pipeta de vidrio está fundida en una fase solvente orgánica (hexadecano), y la presión de la pipeta se mantiene para conseguir un tamaño de burbuja estable. La burbuja está llena espontáneamente de una monocapa de lípidos (lípidos puros o mezcla de lípidos), que se proporciona de liposomas en las burbujas. A continuación, se acoplan las dos burbujas revestimiento de monocapa (~ 50 μm de diámetro) en la punta de las pipetas de vidrio para la formación de la bicapa. Introducción de liposomas canal reconstituido en la burbuja conduce a la incorporación de canales en la bicapa, lo que permite un canal grabación actuales con una relación señal a ruido comparable a la de grabaciones de patch-clamp. CBB con una composición asimétrica de los lípidos se forma fácilmente. El enganche se renueva varias veces soplar las burbujas anteriores y formando otras nuevas. Diversas perturbaciones químicas y físicas (e.g., perfusión de membrana y la bicapa tensión) pueden ser impuestas en el CBB. adjunto, presentamos el procedimiento básico para la formación del CBB.

Introducción

De canales iónicos de la membrana celular no es simplemente un material de apoyo sino un socio para generar el flujo de iones. Funcionalmente, la membrana es un aislador eléctrico en que ion canales están integrados, y todas las membranas celulares son impartidas con un potencial de membrana de reposo. Convencionalmente, se impuso una potencial arbitrario de la membrana de un circuito externo por el cual se midió la corriente eléctrica a través de los canales. Esta evaluación cuantitativa del flujo de iones en potenciales de membrana diferentes reveló las propiedades moleculares de estos canales, como su permeabilidad ion selectivo y bloquea funciones

Protocolo

1. preparar liposomas

1. Dispersar los fosfolípidos (por ejemplo, 10 mg en polvo) en cloroformo a una concentración deseada (p. ej., 10 mg/mL).
2. Evaporar el cloroformo.
   1. Lugar la solución de fosfolípidos en un matraz de fondo redondo y el conjunto en un evaporador rotatorio (véase Tabla de materiales) conectado a un cilindro de gas N₂ . Gire el frasco bajo el flujo de N₂ a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fina de fosfolípido (después de ~ 30 min).
   2. Coloque el frasco abierto en un desecador que está conectado a una bomba de vacío. Usando la bomba de vacío, aspi....

Resultados

Un enganche típico tenía un diámetro de 50 μm (figura 56) y la capacitancia de membrana específicos en hexadecano fue 0.65 μF/cm². El tamaño de la burbuja fue arbitrariamente controlado por la presión intra-burbuja. Cuando pequeñas burbujas son necesarias para grabaciones de poco ruido, el diámetro de la punta debe ser correspondientemente pequeño. Por ejemplo, para un tamaño de burbuja de 50 μm de diámetro, el diámetro de la punta.......

Discusión

El método de enganche de la formación de la bicapa de lípidos se basa en el principio de una gotita de agua en aceite, revestido por una monocapa²⁰. Técnicamente, los procedimientos para la formación de CBB son fáciles, especialmente para los investigadores de la abrazadera del remiendo, que son expertos en manipular Micropipetas de vidrio. La configuración electrofisiológica para la abrazadera del remiendo se utiliza fácilmente en el CBB cuando dos manipuladores de la pipeta con micromanipuladore.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Azolectina (L-&alfa;-Fosfatidilcolina, Tipo IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
Convertidor A/D	Divicios moleculares	Digidata1550A
Electrodo de Ag/AgCl	Warner Instruments	64-1317
Sonicador de baño	Branson	M1800H-J
Cámara	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Capilar de vidrio	Aparato Harvard	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Portaobjetos de orificioVidrio	Matsunami Microscopio	invertido
	Olympus	IX73
Mesa de aislamiento	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulador	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
			micropipeta
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Amplificador de abrazadera de parche	HEKA	EPC800
Extractor de pipetas	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)	Lípidos polares Avanti	850457
POPE (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina )	Lípidos polares Avanti	850757
POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) )	Lípidos polares Avanti	840457 cloruro
de potasio	Nacalai	28514-75
Evapolador rotativo	Iwaki	REN-1000
Ácido succínico	Nacalai	32402-05
Bomba de vacío	Buchi	V-100

de vidrio S339929 Soporte de