Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

Summary

Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.

Abstract

Las células de T utilizan diferentes programas metabólicos para que coincida con sus necesidades funcionales durante la diferenciación y proliferación. Las mitocondrias son componentes celulares cruciales responsables de suministro de energía de la célula; sin embargo, las mitocondrias exceso también producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que podrían causar la muerte celular. Por lo tanto, el número de mitocondrias debe ajustarse constantemente para satisfacer las necesidades de las células. Esta regulación dinámica se consigue en parte mediante la función de los lisosomas que eliminar macromoléculas y organelos superávit o dañado. Por lo tanto, contenido lisosomal y mitocondrial celular es indicadores clave para evaluar la regulación metabólica de las células. Con el desarrollo de sondas para organelos, bien caracterizado lisosoma o tintes específicos de las mitocondrias se han convertido en disponibles en varios formatos para etiquetar las mitocondrias y los lisosomas celulares. Citometría de flujo multicolor es una herramienta común a fenotipos de células de perfil y tiene la capacidad de integrarse con otros ensayos. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo combinar tintes organelas específicas con marcadores de superficie de tinción para medir la cantidad de lisosomas y mitocondrias en la célula de T de diferentes poblaciones en un citómetro de flujo.

Introduction

La activación y proliferación de células T son pasos críticos para montar respuesta inmune exitosa. Los avances recientes sugieren que el metabolismo celular está estrechamente asociado con el desarrollo y funciones de las células. Por ejemplo, las células Naive T dependen en gran medida fosforilación oxidativa (OXPHOS) para satisfacer la demanda de energía durante la recirculación entre los órganos linfoides secundarios. Tras la activación, ingenuo T células sufren drásticas reprogramación metabólica, incluyendo la inducción de la glucólisis aeróbica para aumentar la producción de ATP y para satisfacer las demandas metabólicas tremenda durante la proliferación y dife....

Protocol

El procedimiento de cosecha de tejido de ratón descrito aquí ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Yang Ming.

1. preparación de la suspensión de linfocitos de órganos linfoides

1. Eutanasia el ratón por un método aprobado como inhalación de CO₂ en una cámara de acrílico transparente seguida por dislocación cervical para asegurar la muerte.
   Nota: Mantener la tasa de flujo de CO₂ para un desplazamiento de 20% por minuto de la cámara y no superior a 5 psi (libra por pulgada cuadrada). Tarda 2-3 minutos para un ratón a perder el conocimiento. Ma....

Results

Identificación de subconjuntos principales de la célula T en bazo y timo

En breve, suspensiones de la célula del bazo y el timo fueron lisis de glóbulos rojos, se incubaron con sobrenadante 2.4G2, seguidos por organelas específicas tinte y superficial del marcador tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia (tabla 1). La progresión en el desarrollo de los timocitos puede describirse usa.......

Discussion

Este protocolo combina tintes específicos de organelas y marcador superficial de coloración para cuantificar la cantidad de mitocondrias o lisosomas en poblaciones de células T diferentes. Este método fue desarrollado para superar la limitación de los requisitos de número y homogeneidad celular por métodos tradicionales, como la microscopia electrónica y el análisis de immunoblot. Es especialmente útil en el análisis de poblaciones celulares raros y examinar simultáneamente múltiples tipos de células al mismo tiempo.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinza Graefe de 10 cm (recta y dentada)	Tijera Dimeda
11 cm Iris (recta con cabezas afiladas/afiladas)	Dimeda
15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650
Jeringa de 5 mL	TERUMO
Placa de Petri de 6 cm	α-plus
70 µ m filtro de celdas de nylon	SPL Lifesciences	93070
Cloruro de amonio (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-ratón CD25	Biolegend	102007	Clon:PC61
Anti-ratón CD4	Biolegend	100453	Clon:GK1.5
Anti-ratón CD44	Biolegend	103029	Clon:IM7
Anti-ratón CD62L	Biolegend	104407	Clon:MEL-14
Anti-ratón CD8	Biolegend		100713 Clon:53-6.7
Anti-ratón TCR y beta;	Biolegend	109233	Clon:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Tubo de poliestireno de fondo redondo (tubo FACS)	BD Biosciences	352052
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hidroxietil piperazinaetanoácido sulfónico (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamina (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Aminoácidos no esenciales (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Bicarbonato de potasio (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Solución de yoduro de propidio	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medio (polvo)	Gibco	31800089
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma	S5761
Piruvato de sodio (100 mM)	Gibco	11360070