Artículo de método

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

DOI:

10.3791/58845

⸱

14 de marzo de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

Resumen

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Propagación del virus es una causa importante de enfermedades epidémicas. Por lo tanto, comprender la interacción entre el virus y el anfitrión es muy importante ampliar nuestro conocimiento de la prevención y el tratamiento de la infección viral. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha demostrado para ser uno de los organismos modelo más eficiente y productivo de factores antivirales y investigar interacción virus-huésped, debido a poderosas herramientas genéticas e inmune innata altamente conservado vías de señalización. El procedimiento descrito aquí muestra un método de inyección de nano para establecer infección viral e inducir respuestas antivirales sistémicas en moscas adultas. El control preciso de la dosis de inyección viral en este método permite alta reproducibilidad experimental. Protocolos descritos en este estudio incluyen la preparación de moscas y el virus, el método de inyección, análisis de la tasa de supervivencia, la medición de la carga de virus y una evaluación antiviral vía. Los efectos de la influencia de la infección viral por el fondo de las moscas fueron mencionados aquí. Este método de infección es fácil de realizar y cuantitativamente repetible; se puede aplicar para detectar host viral factores que intervienen en la interacción virus-huésped y diseccionar la diafonía entre inmune innata de señalización y otras vías biológicas en respuesta a la infección viral.

Introducción

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Emergentes de infecciones virales, especialmente por arbovirus, como el Chikungunya virus1, el virus del Dengue, la fiebre amarilla virus2 y elvirusZika3, han sido una gran amenaza para la salud pública al causar pandemias 4. por lo tanto, una mejor comprensión de la interacción virus-huésped se ha convertido en cada vez más importante para el control epidémico y tratamiento de enfermedades virales en los seres humanos. Para este objetivo, se establecerá modelos más adecuados y eficaces para investigar los mecanismos subyacentes a la infección del virus.

La mosca de la fruta, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), proporciona un poderoso sistema para investigar el virus host interacción5,6 y ha demostrado para ser uno de los modelos más eficientes para estudiar enfermedades virales humanas7 , 8 , 9. antiviral altamente conservado señalización vías y herramientas genéticas incomparables que vuela un gran modelo para producir resultados significativos, con implicaciones reales para estudios en humanos de antivirales. Además, las moscas son fáciles y baratos de mantener en el laboratorio y son convenientes para la investigación a gran escala de nuevos factores reguladores6,10 en el virus y el huésped durante la infección.

Cuatro principales vías antivirales altamente conservadas (por ej., el RNA de interferencia (ARNi) vía11, la vía JAK-STAT del12, la vía de NF-κB y la vía de la autofagia13) están bien estudiadas en Drosophila en los últimos años6. El camino de RNAi es un amplio mecanismo antiviral que puede suprimir la mayoría de las clases de virus infección6,14. Interrupción de esta vía por mutación en genes como Dicer-2 (Dcr-2) o 2 Argonaute (antes2) puede llevar a mayor virus título y host mortalidad15,16,17. La vía JAK-STAT se ha implicado en el control de la infección por el virus de la familia Dicistroviridae y la familia Flaviviridae de insectos, por ejemplo., el virus C de Drosophila (DCV) en moscas16 y virus del Nilo Occidental (VNO) y el Virus del Dengue en mosquitos18,19. El Toll de Drosophila (homólogo a la humana vía NF-κB) y vías (IMD) de la deficiencia inmune (similares a la vía de NF-κB y TNF humana) están involucrados en la defensa de virus invasión20,21, 22. autofagia es otro mecanismo conservado implicado en la regulación de la infección viral, que se caracteriza también en Drosophila23,24. Así, la identificación de nuevos factores reguladores de estas vías y disección interferencia entre estas señales antivirales y otras vías biológicas, tales como metabolismo, envejecimiento, reacción neural y así sucesivamente, se pueden configurar fácilmente en la Drosophila sistema.

Aunque más bien establecidos modelos infecciosos virales en Drosophila son inducidos por virus ARN, la infección por los invertebrados 6I de Virus iridiscente (IV-6) y virus de Kallithea han demostrado el potencial para el estudio de los virus ADN en moscas25, 26. Por otra parte, los virus pueden modificarse para permitir la infección de Drosophila, como el virus de la influenza9. Esto ha ampliado enormemente la aplicación de la plataforma de proyección de Drosophila . En este procedimiento utilizamos DCV como ejemplo para describir cómo desarrollar un sistema viral infeccioso en Drosophila. DCV es un virus trenzado solo ARN de sentido positivo de nucleótidos aproximadamente 9300, codificación de proteínas 927. Como un patógeno natural de D. melanogaster, DCV se considera como un virus conveniente estudiar inmunorespuesta fisiológico, conductual y basal del anfitrión durante virus host interacción y co-evolución28. Además, su rápida mortalidad después de la infección en moscas tipo salvaje hace DCV útil para detectar genes resistentes o susceptibles en el host29.

Sin embargo, hay varios aspectos de interés en el estudio de infecciones virales en Drosophila. Por ejemplo, simbióticas bacterias Wolbachia tienen una capacidad de inhibir un amplio espectros de la proliferación de virus ARN en Drosophila y mosquito30,31,32. La evidencia reciente muestra un posible mecanismo en que Wolbachia bloques Sindbis (SINV) infección por virus a través de la regulación al alza de methyltransferase expresión Mt2 en el host33. Además, el fondo genético de insectos también es crítico para la infección viral. Por ejemplo, el natural polimorfismo en el gen, pastrel (pst), determina la susceptibilidad a la infección de DCV en Drosophila34,35, mientras que los lugares geométricos de Ubc-E2H y CG8492 participan en el virus de la parálisis del grillo (CrPV) y la infección por el virus (FHV) casa rebaño, respectivamente36.

Las particulares maneras de establecer la interacción virus-huésped en moscas, deben ser elegidos según los propósitos de la investigación como una pantalla de alto rendimiento para los componentes celulares del anfitrión en Drosophila la célula líneas37,38, oral infección para estudiar respuesta antiviral específico de tripa22,39,40, aguja que pincha41,42 o nano-inyección pasando barreras epiteliales para estimular a inmunológico sistémico respuestas. Nano-inyección puede controlar con precisión la dosis viral para inducir una reacción controlada de antiviral y una lesión fisiológica43, garantizando alta reproducibilidad experimental44. En este estudio, se describe un método de inyección de nano para estudiar interacciones virus-huésped en Drosophila, resaltando la importancia de los efectos del fondo de las moscas.

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Protocolo

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Nota: Antes de comenzar el experimento, las líneas celulares y las poblaciones de mosca utilizadas deben no ser contaminadas por otros patógenos, especialmente para virus como el DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) y virus de la nefritis aviar (ANV). Idealmente, la secuencia de RNA o una identificación de polimerización en cadena-basado más simple se utilizan para detectar contaminación10,45. Si la contaminación se produjo, las líneas celulares y las poblaciones de mosca no deberían utilizarse más hasta que estén completamente descontaminados46.

1. virus y preparación mosca

  1. Recolección y propagación de virus
    Nota: Drosophila S2 * las células se utilizan para la valoración y la propagación de DCV. La línea S2 * celular se deriva de un cultivo primario de embriones en fase finales de D. melanogaster . Esta línea celular ha sido bien descrito previamente47.
    1. Crecen S2 * células en medio de Drosophila de Schneider a 25 ° C sin más CO2, como una monocapa suelta, semi-adherente en una placa de cultivo celular de 10 cm, con una densidad de 1 x 107 células viables/mL. Medio completo uso S2 * células: medio de Drosophila de Schneider que contiene 10% de calor inactiva FBS, 100 unidades/mL penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
      Nota: Las células sanas deben mostrar una forma redonda y exhiben tamaño homogéneo.
    2. Descongelar rápidamente el stock DCV de-80 ° C en un baño de agua de 25 ° C. Infectar células S2 * con el DCV en MOI = 0.01 inmediatamente añadiendo 1 mL de la solución antivirus directamente a los platos de cultivo celular (zona de crecimiento: 55 cm2) con 10 mL de medio completo para S2 * células.
    3. Incubar las células a 25 ° C durante 3 a 5 días. Cuando el virus está listo para la colección, la morfología de la célula es anormal (forma de la célula se ve borroso) y el medio de cultivo está lleno de partículas negras de restos celulares.
    4. Recoger la cultura de célula entera en un tubo de 15 mL por pipeteo arriba y abajo y congelar a-80 ° C (de hasta un año).
      Nota: DCV puede almacenarse por períodos prolongados de tiempo a-80 ° C con una mínima pérdida de infectividad, hasta por un año.
    5. Descongelar el cultivo celular en un baño de agua de 25 ° C con agitación constante y luego centrifugar a 6.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante en un tubo estéril de 15 mL y agitar. Alícuota hasta 200 μL de solución de virus por el tubo.
      Nota: Alícuotas de Virus se pueden almacenar por períodos cortos de un máximo de 3 días a 4 ° C y hasta por 1 año a-80 ° C. Debe evitarse la congelación y descongelación repetida. Siempre es mejor utilizar la alícuota a la vez.
    6. Tomar 5 tubos que contienen el virus al azar para determinar la dosis infecciosa de virus medio cultivo de tejidos (TCID50) por un análisis de efecto citopático (CPE) (1 unidad de TCID50= 0.7 placa formando unidad [PFU]).
      Nota: La CPE se refiere a los cambios estructurales en las células del huésped causados por la invasión viral. El virus infeccioso causa lisis de la célula huésped o cuando la célula muere sin lisis debido a una incapacidad para reproducir48.
      1. El día 1, recoger preparado S2 * células mediante pipeteo. Contar el número de celular. Centrifugar las células para 300 x g durante 4 min y descarte el sobrenadante. Diluir las células a la densidad de 1 x 106 células/mL con medio completo para S2 * células como se describe en el paso 1.1.1.
      2. Semillas de 1 x 105 S2 * (100 μL) de células por pocillo a la plana 96-bien-placa inferior (confluencia de ~ 30%).
      3. Realizar diluciones seriadas 10 veces de la acción DCV con medio completo para S2 * células. Añadir 50 diluciones μL en el pozo. Añadir 50 μl de medio de cultivo sin virus al pozo clasificado como control negativo bien.
        Nota: Para cada velocidad de dilución, se utilizaron 8 pocillos. Como el rendimiento típico de DCV es de8-10 109 PFU/mL, la dilución debe cubrir por lo menos ~ 10-5-10-10.
      4. El día 4, observar CPE con un microscopio de campo brillante con un 20 X o 40 X objetivo. Clasificar un pozo en el que las células borrosas y el medio está lleno de fragmentos como un "bien positivo" y un pozo en el que la morfología de la célula es normal como "bien negativo".
      5. Pozos positivas o negativas de Mark CPE con + o-, respectivamente. Calcular el virus TCID50 por el método de Reed y Muench49.
    7. Deseche todos los materiales contaminados y guantes en el recipiente de la descontaminación. Si el virus no puede alcanzar la deseada TCID50, 100 mL de solución de antivirus se concentran por centrifugación a 68.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
      Nota: dependiendo del objetivo del experimento, un rango de dosis de 102 a 10 unidades6 DICT50 puede ser utilizado para la infección del virus. Por lo general, utilizamos 3 x 106 DICT50 unidades.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de tampón Tris-HCl (10 mM, pH 7,2). Alícuota 20 μL de solución de virus por el tubo y conservar a-80 ° C. Tomar 5 tubos al azar para determinar el virus media TCID50 otra vez.
  2. Preparación para la infección de la mosca
    Nota: Simbióticas bacterias Wolbachia pueden suprimir muchos tipos de infección por virus de RNA en insectos30,31,32,33,41. Por lo tanto, es esencial para purgar de Wolbachia de moscas antes de estudiar la infección virus host en vivo33.
    1. Preparar comida mosca contiene tetraciclina al añadir 400 μL de 50 tetraciclina μg/mL (en etanol al 70%) a 4 g de comida de mosca fresca harina estándar (1 L de alimentos contiene 77,7 g de harina de maíz, 32,19 g de levadura, 10,6 g de agar, 0,726 g de CaCl2 31,62 g de sacarosa, 63,3 g de glucosa, 2 g de sorbato de potasio y 15 mL de 5% C8H8O3). Mezcle bien y coloque los alimentos a 4 ° C durante la noche para evaporar el etanol.
      Nota: Una alta dosis de etanol puede afectar la fertilidad de mosca, para no omitir este paso.
    2. Calentar los alimentos a temperatura ambiente y recién eclosed moscas adultas (20 hembras y 10 machos) en el frasco. Se crían las moscas a 25 ° C, 60% de humedad en un ciclo normal de luz/oscuridad.
      Nota: Por lo general, tarda 3-4 días para las moscas a poner suficientes huevos. Demasiados huevos, impiden el desarrollo de larvas y disminuyen la eficacia de la tetraciclina.
    3. Recoger nuevas moscas adultas eclosed (dentro de 3 ~ 5 días) bajo un flujo de CO2y repita el paso ~ 1.2.1-1.2.2. Por lo general, por lo menos 3 generaciones se necesitan para totalmente la eliminación de Wolbachia.
    4. Después de 3 generaciones con tratamiento de tetraciclina, recoger 5 moscas en un flujo de CO2 para la prueba de infección por Wolbachia . Muela de moscas durante 1 min con 250 μL de agua destilada doble (ddH2O) y algunas perlas cerámica estéril de 0,5 mm en un tubo de 1,5 mL utilizando un homogeneizador. Añadir otro 250 μL de 2 x tampón A (0,2 M Tris-HCl, pH 9.0, 0.2 M de EDTA, SDS 2%) a la muestra y vortex.
      Nota: Puesto que SDS impedirá el movimiento del grano, 1 x buffer A no puede ser utilizado directamente para moler moscas. Si las moscas tienen ojos rojos, quitar cabezas antes de molerlo, como esto puede influir en el color del producto de la DNA.
    5. Congelar las muestras a-80 ° C (mantener hasta un año). Rápidamente descongelar la muestra de-80 ° C en un baño de agua de 25 ° C hasta que se disuelva. Incubar las muestras a 70 ° C por 30 minutos.
    6. Añadir 190 μL de 5 M KOAc, vortex e incubar en hielo por 15 minutos o más.
    7. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente, recoger el sobrenadante y transferir a tubos nuevos.
    8. Repita el paso 1.2.7 para obtener ADN de mejor calidad.
    9. Añadir 750 μL de isopropanol a cada muestra e invierta suavemente un par de veces con la mano. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    10. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. El precipitado de ADN genómico blanco permanecerá en la parte inferior del tubo.
    11. Añadir 1 mL de etanol al 70% a los pellets, centrifugar a 13.000 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Deje secar al aire la DNA hasta que esté transparente.
    12. ADN se disuelven en 100 μL de ddH2O, valorar la concentración de ADN por espectrofotometría de absorción UV-Vis y diluir el ADN a 100 ng/μL.
    13. Uso 200 ng de ADN por la reacción de PCR (en un sistema de 20 μL, vea la Tabla de materiales). Realizar PCR mediante el siguiente programa: 95 ° C durante 15 min; 36 ciclo de 95 ° C por 45 s, 50 ° C por 45 s y 72 ° C por 1 min; y a un paso de extensión final (72 ° C por 1 min) en un termociclador.
      Nota: Basado en la Wolbachia 16S rRNA, utilice los siguientes cebadores: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (adelante) y 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (atrás). Para wsp, fueron los primers 5' CATTGGTGTTGGTGTTGGTG 3' (adelante) y 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (atrás).
    14. Análisis de productos PCR con electroforesis en gel de agarosa al 1%. El tamaño del producto PCR de Wolbachia 16S rRNA y wsp es alrededor de 200 bp y 600 bp, respectivamente.
    15. Posterior Wolbachia libre stock mosca mosca comida de harina estándar. Recoger 3-5 días recién eclosed hombre vuela para la infección.
      Nota: Tratamiento de tetraciclina también puede afectar a composición de la microbiota intestinal, que posteriormente influye en las respuestas antivirales en el host. Recomendamos que todas moscas deben recibir los mismos tratamientos de tetraciclina. Mantener libre de Wolbachia moscas creciendo bajo condiciones estándar de al menos 3 generaciones restablecer la microbiota intestinal.
  3. Pastrel genotyping
    Nota: La presencia del alelo S o R del gene del pst en el fondo genético se ha divulgado para afectar la infección DCV en Drosophila34,35. Es necesario comprobar el genotipo de la pst , especialmente para la infección de DCV. Hay unos pocos SNPs en pst que puede afectar a la infección del virus, el SNP mayor es 512 C/T. El gradiente de temperatura PCR es un método rápido para identificar el genotipo de pst .
    1. Extracto de volar ADN genómico como se describió anteriormente (paso 1.2.4 - 1.2.15).
    2. Uso 100 ng de ADN como plantilla, la cartilla C 512, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3' (adelante) y 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (atrás) para detectar el alelo R, la cartilla 512T, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3' (adelante) y 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (atrás) para detectar la Alelo S.
    3. Establecidas en los gradientes de Tm (temperatura de fusión): 54 ° C 54,7 º C, 55,5 C °, 58 ° C, 59,7 ° C, 62,2 ° C, 63,7 ° C y 64 ° C (45 s a cada temperatura).
      Nota: 30 ciclos de PCR reacción en cadena se recomiendan (sistema de 20 μL).
    4. Visualizar el producto PCR 100-bp por electroforesis del gel de agarosa al 2%.

2. viral infección en Drosophila

  1. Infectar moscas por nano-inyección y realizar análisis de supervivencia.
    1. Tire los capilares para preparar agujas de inyección, back-fill la inyección de la aguja con el aceite y montar el inyector como describió anteriormente50.
    2. Anestesiar a moscas en la almohadilla debajo de un flujo de CO2. Inocular de moscas por inyección intra torácica44 50.6 nL de solución antivirus (100 PFF, diluir con tampón Tris-HCl, pH 7.2). Inyectar por lo menos 3 frascos de moscas (20 moscas por frasco).
      Nota: La inyección es desperdiciador de tiempo (generalmente 100 moscas por hora) y DCV la reproducción es muy rápida, por lo que es muy importante anotar la hora exacta en el tubo una vez acabado cada vial (20 moscas). Inyección única de búfer se define como un control simulado. Moscas adultas masculinas son generalmente, prefiere, como resultados son más estables y reproducibles que cuando las hembras ya que las variaciones hormonales durante el apareamiento y la reproducción pueden influir en la lectura de las hembras51.
    3. Crecen las moscas inyectados a 25 ° C, 60% de humedad en un ciclo normal de luz/oscuridad. Fuente de moscas con el alimento fresco diario y anote el número de muertos flies.
    4. Realizar al menos 3 repeticiones biológicas y trazar la curva de supervivencia.
    5. Para el análisis estadístico de los datos de supervivencia, generar las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de software estadístico. Realizar prueba de log-rank para calcular los valores de P. En la tabla de supervivencia, ingrese la información de cada materia. El software calcula la supervivencia porcentual en cada momento y traza una trama de supervivencia de Kaplan-Meier.
      Nota: No agregue levadura adicional en el frasco. En comparación con controles de simulacros, moscas infectadas DCV ocasionalmente tienen ascitis y son torpes, que hacen vulnerables a la levadura pegajosa. Es mejor registrar más puntos del tiempo en el experimento preliminar para un marco de tiempo en que sucederá la muerte masiva de moscas infectadas. Generalmente, las moscas infectadas rara vez mueren dentro de los dos primeros días, incluso para las líneas mutantes Dcr-2 . Para la Wolbachia w gratis1118 (Bloomington 5905) mosca infectada con 100 PFU del DCV, esta ventana de tiempo es alrededor de 3-5 días post infección. Moscas de la fruta que mueren dentro de las horas de la inyección de 0.5 h post debe no ser contados como una fatalidad porque puede ser muertos por heridas de aguja no por infección viral.
  2. DCV carga medida por análisis de la CPE
    Nota: La carga Viral se mide semejantemente a la valoración de la acción de virus (paso 1.1.6) pero requiere preparación adicional (paso 2.2.1-2.2.4).
    1. El día 1, infectar moscas macho como se describe en el paso 2.1.1-2.1.2. Grupo inyectado vuela en grupos de 20 y mantenerlos creciendo en alimentos frescos de mosca para el tiempo deseado (normalmente de 24 h o 3 días). Proporciona moscas alimentos frescos todos los días.
    2. En el día 2, semilla de Drosophila S2 * células en una placa de cultivo celular de 10 cm a la densidad de aproximadamente 5 x106 a 1 x 107 células/mL como se describe en el paso 1.1.1.
    3. El día 3, recoger 5 moscas (bajo un ligero flujo de CO2) y molerlos en un tubo de centrífuga de 1.5 mL por 30 s con 200 μL de tampón Tris y granos de cerámica usando homogeneizador. Almacenar las muestras a-80 ° C o proceder inmediatamente al siguiente paso.
    4. Fondo vortex la muestra. Utilice una jeringa de 1 mL y 0.22 μm filtro a filtro el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Proceder a la valoración, como se describe en pasos 1.1.6.1-1.1.6.5.
  3. Carga DCV medido por qRT-PCR
    1. El día 1, infectar moscas como se describió anteriormente. Grupo inyectado macho vuela (20 moscas/grupo) y crecen en alimentos frescos de mosca para el tiempo deseado, normalmente para 24 horas o 3 días. Proporciona moscas alimentos frescos todos los días.
    2. El día 3, recoger 5 moscas en un flujo de CO2 en un tubo de 1,5 mL con 200 μL de tampón de lisis y 20 granos de cerámica (diámetro = 0,5 mm), moler las muestras por el homogeneizador de alta velocidad para 30 s. Añadir 800 μL de tampón de lisis adicional a cada tubo y guardar el s amplios a-80 ° C o inmediatamente realizan extracción de RNA y qRT-PCR.
    3. Preparar consejos libres de Rnasa, tubos y desionizada, diethylpyrocarbonate (DEPC) tratados y 0.22 μm membrana filtra agua. Añadir 200 μL de cloroformo (≥99.5%) en la muestra y vigorosamente agite por 15 s a mano. Incubar durante 5 minutos o más a temperatura ambiente hasta que la fase líquida y la fase orgánica se separan claramente.
      Nota: El cloroformo es extremadamente peligroso y debe ser manipulado con cuidado. No no agitar con vortex de la muestra, lo que aumentará el riesgo de contaminación del ADN.
    4. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    5. Recoger 400 μL del sobrenadante y transferir el sobrenadante a tubos nuevos. Mezclar con el mismo volumen isopropanol (≥ 99.5%), invierta suavemente las muestras de 20 veces a mano y luego precipitar durante 10 minutos o más a temperatura ambiente.
      Nota: Precipitación a-20 ° C aumentará producción de RNA.
    6. Centrifugar las muestras a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C. Gránulos de ARN blanco son visibles en la parte inferior del tubo.
    7. Deseche el sobrenadante y agregar 1 mL de etanol al 70% (etanol en agua DEPC) e invertir varias veces para lavar el ARN.
    8. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y seco ARN durante 5-10 min; RNA debe ser transparente.
    9. Añadir 50 μL de agua DEPC a la muestra, la pipeta para par de veces y vortex.
    10. Tomar 3 μL del ARN para valorar la concentración de RNA. Cuantificar el RNA a 260 nm. Normalmente, la concentración de RNA extraída por este protocolo es aproximadamente 100-500 μg/μL, que es adecuado para síntesis de cDNA.
    11. Uso 2 μg de ARN para la síntesis de cDNA. Diluir la muestra a 100 μL con ddH2O y almacenar a-20 ° C.
    12. Realice qRT-PCR según las instrucciones del fabricante y ejecute qRT-PCR.
      Nota: Para síntesis de cDNA de DCV, random primers trabajaban mucho mejor que el primer poli A en nuestras manos. Expresión de mRNA DCV se normaliza a proteínas endógenas mRNA (rp49) 49. Cartillas del oligonucleótido utilizados en esta parte: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (adelante) y 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (atrás); DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (adelante) y 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (atrás); vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (adelante) y 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (atrás); inducido por virus RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (adelante) y 5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (atrás).

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Resultados

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Resultados de esta sección se obtienen después de la infección de DCV de D. melanogaster. La figura 1 muestra el organigrama de la infección viral en Drosophila. Moscas se inyectan intra thoracically, y luego se recogen las muestras para la medición de la viral TCID50 y el nivel de ARN del genoma (figura 1). La infección del virus puede inducir lisis celular y CPE se observa en 3 días post infección (figura 2A). De acuerdo con la carga del vi...

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Discusión

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En este artículo, presentamos un procedimiento detallado sobre cómo establecer un sistema viral infeccioso en adultos de Drosophila melanogaster utilizando nano-inyección. Los protocolos incluyen la preparación de líneas moscas apropiadas y stock de virus, técnicas de infección, la evaluación de indicadores de infecciosas y la medición de la respuesta antiviral. Aunque el DCV se utiliza como un ejemplo de un patógeno viral, decenas de diferentes tipos de virus se ha aplicado con éxito para el estudio en el siste...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al laboratorio de Pan todo en IPS. CAS. Agradecemos Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) asistencia experimental y Dr. Gonalo Cordova Steger (naturaleza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, París) y el Dr. Seng Zhu (IPS, París) Comentarios. Este trabajo fue financiado por becas del programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias L.P (XDA13010500) y HT (XDB29030300), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China a L.P (31870887 y 31570897) y J.Y (31670909). L.P es miembro de la Asociación de promoción de innovación CAS juvenil (2012083).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de 0,22 mmMilliporeSLGP033RS
1,5 ml Tubos de microcentrífugaMarca352070
1,5 ml Tubos de microcentrífuga sin ARNasaAxygenMCT-150-C
Placa de cultivo celular de 10 cmSigmaCLS430167Cell culture
100 Tubos de repuestoDrummond Scientific3-000-203-G/X
Tubo de 15 mlCorning352096
Sistema de qPCR ABI 7500Incubadora de células qPCR
SanyoMIR-553
CentrífugaEppendof5810R
Centrífuga5424R
CloroformoSigma151858Extracción de ARN
DEPC aguaSigma95284-100ML Extracción deARN
Drosophila IncubadoraPercivalI-41NLCría Drosophila
FBSInvitrogen12657-029Cultivo celular
fondo plano placa de 96 pocillosSigmaCLS3922Cultivo celular
Microscopio de fluorescenciaOlympusDP73
Alcohol isopropílicoSigmaI9516
(extracción de ARN)Tampón dereactivo Thermo Fisher 15596026 TRIzol
(extracción de ARN de muestra líquida)Thermo Fisher10296028TRIzol LS
InyectorOlympusCKX41
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204Nanoject II Inyector automático de volumen variable (2,3 a 69 nL) con capilares de vidrio (110 V)
Película adhesiva ópticaABI4360954qPCR
Penicilina-estreptomicina,invitrogen15140-122 Placa de
qPCRABIA32811qPCR
Schneider' s Medio para insectosSigmaS9895cultivo celular
GraphPad Prisma 7
TransScript Mosca de primera cadena Síntesis de ADNc SuperMixTransScriptAT301Extracción de
ARN VortexIKAVORTEX 3Extracción de ARN
Tampón de lisis de extracción de ARN lisis de Microscopio de reactivo de nanolitros automático líquido para cultivo celular Software estadístico de

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