Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

Shuo Yang; Yaya Zhao; Junjing Yu; Zhiqin Fan; Si-tang Gong; Hong Tang; Lei Pan

doi:10.3791/58845

Artículo de método

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

DOI:

10.3791/58845

⸱

14 de marzo de 2019

Shuo Yang^*¹^,²^,³ , Yaya Zhao^*¹^,² , Junjing Yu⁴ , Zhiqin Fan² , Si-tang Gong¹ , Hong Tang¹^,² , Lei Pan¹^,²^,³

¹The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, ²CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, ³CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, ⁴Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

Resumen

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Propagación del virus es una causa importante de enfermedades epidémicas. Por lo tanto, comprender la interacción entre el virus y el anfitrión es muy importante ampliar nuestro conocimiento de la prevención y el tratamiento de la infección viral. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha demostrado para ser uno de los organismos modelo más eficiente y productivo de factores antivirales y investigar interacción virus-huésped, debido a poderosas herramientas genéticas e inmune innata altamente conservado vías de señalización. El procedimiento descrito aquí muestra un método de inyección de nano para establecer infección viral e inducir respuestas antivirales sistémicas en moscas adultas. El control preciso de la dosis de inyección viral en este método permite alta reproducibilidad experimental. Protocolos descritos en este estudio incluyen la preparación de moscas y el virus, el método de inyección, análisis de la tasa de supervivencia, la medición de la carga de virus y una evaluación antiviral vía. Los efectos de la influencia de la infección viral por el fondo de las moscas fueron mencionados aquí. Este método de infección es fácil de realizar y cuantitativamente repetible; se puede aplicar para detectar host viral factores que intervienen en la interacción virus-huésped y diseccionar la diafonía entre inmune innata de señalización y otras vías biológicas en respuesta a la infección viral.

Introducción

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Emergentes de infecciones virales, especialmente por arbovirus, como el Chikungunya virus¹, el virus del Dengue, la fiebre amarilla virus² y elvirusZika³, han sido una gran amenaza para la salud pública al causar pandemias ⁴. por lo tanto, una mejor comprensión de la interacción virus-huésped se ha convertido en cada vez más importante para el control epidémico y tratamiento de enfermedades virales en los seres humanos. Para este objetivo, se establecerá modelos más adecuados y eficaces para investigar los mecanismos subyacentes a la infección del virus.

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Protocolo

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Nota: Antes de comenzar el experimento, las líneas celulares y las poblaciones de mosca utilizadas deben no ser contaminadas por otros patógenos, especialmente para virus como el DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) y virus de la nefritis aviar (ANV). Idealmente, la secuencia de RNA o una identificación de polimerización en cadena-basado más simple se utilizan para detectar contaminación¹⁰^,⁴⁵. Si la contaminación se produjo, las líneas celulares y las poblaciones de mosca no deberían utilizarse más hasta que estén completamente descontaminados⁴⁶.

1. virus y prepa....

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Resultados

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Resultados de esta sección se obtienen después de la infección de DCV de D. melanogaster. La figura 1 muestra el organigrama de la infección viral en Drosophila. Moscas se inyectan intra thoracically, y luego se recogen las muestras para la medición de la viral TCID₅₀ y el nivel de ARN del genoma (figura 1). La infección del virus puede inducir lisis celular y CPE se observa en 3 días post infección (figura 2A). De acuerdo con la carga del vi.......

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Discusión

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En este artículo, presentamos un procedimiento detallado sobre cómo establecer un sistema viral infeccioso en adultos de Drosophila melanogaster utilizando nano-inyección. Los protocolos incluyen la preparación de líneas moscas apropiadas y stock de virus, técnicas de infección, la evaluación de indicadores de infecciosas y la medición de la respuesta antiviral. Aunque el DCV se utiliza como un ejemplo de un patógeno viral, decenas de diferentes tipos de virus se ha aplicado con éxito para el estudio en el siste.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al laboratorio de Pan todo en IPS. CAS. Agradecemos Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) asistencia experimental y Dr. Gonalo Cordova Steger (naturaleza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, París) y el Dr. Seng Zhu (IPS, París) Comentarios. Este trabajo fue financiado por becas del programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias L.P (XDA13010500) y HT (XDB29030300), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China a L.P (31870887 y 31570897) y J.Y (31670909). L.P es miembro de la Asociación de promoción de innovación CAS juvenil (2012083).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de 0,22 mm	Millipore	SLGP033RS
1,5 ml Tubos de microcentrífuga	Marca	352070
1,5 ml Tubos de microcentrífuga sin ARNasa	Axygen	MCT-150-C
Placa de cultivo celular de 10 cm	Sigma	CLS430167	Cell culture
100 Tubos de repuesto	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Tubo de 15 ml	Corning	352096
Sistema de qPCR ABI 7500			Incubadora de células qPCR
	Sanyo	MIR-553
Centrífuga	Eppendof	5810R
Centrífuga		5424R
Cloroformo	Sigma	151858	Extracción de ARN
DEPC agua	Sigma	95284-100ML Extracción de	ARN
Drosophila Incubadora	Percival	I-41NL	Cría Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	Cultivo celular
fondo plano placa de 96 pocillos	Sigma	CLS3922	Cultivo celular
Microscopio de fluorescencia	Olympus	DP73
Alcohol isopropílico	Sigma	I9516
(extracción de ARN)	Tampón de	reactivo Thermo Fisher 15596026 TRIzol
(extracción de ARN de muestra líquida)	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS
Inyector	Olympus	CKX41
Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II Inyector automático de volumen variable (2,3 a 69 nL) con capilares de vidrio (110 V)
Película adhesiva óptica	ABI	4360954	qPCR
Penicilina-estreptomicina,	invitrogen	15140-122 Placa de
qPCR	ABI	A32811	qPCR
Schneider' s Medio para insectos	Sigma	S9895	cultivo celular
	GraphPad Prisma 7
TransScript Mosca de primera cadena Síntesis de ADNc SuperMix	TransScript	AT301	Extracción de
ARN Vortex	IKA	VORTEX 3	Extracción de ARN

Tampón de lisis de extracción de ARN lisis de Microscopio de reactivo de nanolitros automático líquido para cultivo celular Software estadístico de

Referencias

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Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410(2017).
Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever....

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M todo de nanoinyecci n Medici n de la carga viral Evaluaci n de la v a antiviral Moscas libres de Wolbachia Ensayo de efecto citop tico RT PCR cuantitativa Cribado gen tico Inmunidad innata

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