Artículo de método

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

DOI:

10.3791/58895

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19 de mayo de 2019

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1Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction, Institute of Traumatology & Orthopedics, Nanjing University of Chinese Medicine, 2TCM Nursing Intervention Laboratory of Chronic Disease Key Laboratory, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Department of Traumatology and Orthopedics, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

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Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.

Resumen

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Los osteoclastos son células grandes, multinucleadas y que recurren al hueso del linaje de monocitos y macrófagos que se forman mediante la fusión de monocitos o precursores de macrófagos. La resorción ósea excesiva es uno de los mecanismos celulares más significativos que conducen a enfermedades osteolíticas, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica. La principal función fisiológica de los osteoclastos es absorber tanto el componente mineral de hidroxiapatita como la matriz orgánica de hueso, generando la apariencia de resorción característica en la superficie de los huesos. Hay relativamente pocos osteoclastos en comparación con otras células en el cuerpo, especialmente en los huesos adultos. Estudios recientes se han centrado en cómo obtener osteoclastos más maduros en menos tiempo, lo que siempre ha sido un problema. En los laboratorios se han desarrollado varias mejoras en las técnicas de aislamiento y cultivo para obtener osteoclastos más maduros. Aquí, introducimos un método que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional, utilizando un dispositivo especial y simple. Con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados de la médula ósea de rata, que se identifican mediante métodos clásicos.

Introducción

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La la homeostasis ósea es un proceso fisiológico complejo que está regulado por osteoclastos de resorto óseo y osteoblastos de formación ósea1. Un equilibrio entre la actividad osteoblástica y osteoclástica mediada a través de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente, es muy esencial para mantener la salud ósea y la la homeostasis, porque las perturbaciones en la la homeostasis ósea pueden conducir a enfermedades óseas, tales como crecimiento óseo anormal o pérdida de densidad ósea. Como células únicas de resorción ósea, los osteoclastos son importantes en enfermedades relacionadas con la destrucción ósea anormal, incluyendo osteoporosis, p....

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Protocolo

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Todos los métodos que involucran a los animales descritos aquí son aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Medicina China de Nanjing.

1. Setup

  1. Prepare varias puntas de pipetas longitudinalmente cortadas de 1 mL (1 cm) y varios tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Poner las puntas de las pipetas y los tubos de microcentrífuga a 103 kPa y 121 ° c durante 20 min y asegurarse de que son estériles.
  2. Prepare una caja de hielo y varios platos estériles para preservar los tejidos aislados durante el procedimiento de aislamiento.

2. preparación ....

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Resultados

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El propósito del protocolo era aislar y purificar un gran número de precursores de los osteoclastos convenientemente e inducir a los osteoclastos con éxito. Complementando con M-CSF y RANKL, se observaron osteoclastos gigantes en los días 5 – 6. La formación de osteoclastos se identificó con éxito mediante la tinción TRAP (figura 1A). Las células grandes y púrpuras fueron consideradas como células trampa-positivas con múltiples núcleos (típicamente ≥ tres núc.......

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Discusión

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La capacidad de obtener y estudiar osteoclastos in vitro es una habilidad crítica y fundamental para cualquier investigador que desee estudiar el metabolismo óseo, lo que puede ayudar a comprender los mecanismos de las enfermedades que absorben los huesos y desarrollar nuevos agentes terapéuticos. El presente estudio describió un protocolo con algunas modificaciones basadas en métodos anteriores.

Mediante el uso de puntas de pipetas y tubos de microcentrífuga para obtener médula ósea, redujo e.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta obra fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81473692) a Yong MA. Los autores agradecen a todo el personal del centro de investigación médica del primer Colegio de medicina clínica de la Universidad de Medicina China de Nanjing.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de fosfatasa ácida, lecocitos (TRAP)Sigma-Aldrich387A
Cortadora automática de tejidos durosLeciaRM2265
HuesoComprado por nosotros
Incubadora de célulasHerausBB16/BB5060
Suero fetal bovinoSaranas-fbs-au-015
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
Trituradoras de tejidos durosLeciaSP-2600
Kit histopacoTianJing HaoyangTBD2013DRTubo centrífugo silicificado y solución de separación celular
Hochest33342Sigma-AldrichB2261
Microscopio de contraste de fase invertidaOlympusCKX31
Microscopio de fluorescencia invertidaLeciaDMI-3000
MEM, sin glutaminaGibco11090-081
Penicilina-Estreptomicina,Gibcolíquido 15140122
Conejo Receptor anti-calcitoninaBiossbs-0124R
Rata Recombinante M-CSFPeproTech400-28
Rata Recombinante LigandosRANKPeproTech400-30
Tampón de lisis de glóbulos rojosAbsinaabs47014932
Microscopía electrónica de barridoFEIQuanta 200
Toluidina AzulSigma-Aldrich89649
femoral bovino

Referencias

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  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12)....

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Aislamiento de m dula seacentrifugaci n por gradiente de densidaddiferenciaci n de osteoclastostinci n TRAPmicroscop a electr nica de barridotinci n con azul de toluidinaensayo de resorci n seainducci n con M CSF y RANKLsoluci n de separaci n celular

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