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Artículo de método

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

10.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/58901

⸱

6 de marzo de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Resumen

Las células endoteliales de capilares del músculo esquelético (músculo microvascular las células endoteliales, MMEC) construcción la barrera entre la sangre y los músculos esqueléticos que regula el intercambio de fluidos y nutrientes así como la respuesta inmune contra infecciosas agentes de control de la migración de células inmunes. Para estas funciones, forman un funcional MMEC "unidad myovascular" (MVU), con más tipos de células, como fibroblastos y pericitos, células del músculo esquelético. Por lo tanto, una disfunción de MMEC y por lo tanto la MVU contribuye a una gran variedad de miopatías. Sin embargo, mecanismos de MMEC en la salud y la enfermedad siguen siendo insuficientemente comprendidos y su elucidación precede a tratamientos más específicos para miopatías. El aislamiento y la investigación en profundidad de funciones primarias de MMEC en el contexto de la MVU podrían facilitar una mejor comprensión de estos procesos.

Este artículo proporciona un protocolo para aislar MMEC murino primaria del músculo esquelético por la disociación mecánica y enzimática, incluyendo purificación y pasos de mantenimiento de la cultura.

Introducción

Órganos, células y a través de torrente sanguíneo están provistos de oxígeno, substratos y otras moléculas necesarias. Este intercambio tiene lugar en los capilares, los vasos más pequeños. Los capilares están formados por una capa interna células endoteliales (CE), cuya integridad es un pre-requisito para la exitosa regulación de la homeostasis del músculo entre el espacio intravascular e intersticial. Para asegurar una transición selectiva de células y factores solubles, CE constituyen un monocapa interconectados por apretada y de las ensambladuras de los adherens 1. Además de su papel como barrera para alimentos o productos metabólicos, CE regular el reclutamiento de leucocitos en los procesos inflamatorios. Inflamación o tejido daños conduce a una para arriba-regulación de moléculas de adhesión en la superficie de la CE y la producción de quimiocinas facilitando el apego del leucocito y transmigración en los tejidos de destino 2. En consecuencia, CE están implicados críticamente en la regulación de procesos inflamatorios como la defensa contra agentes patógenos o reparación de los tejidos.

Una disfunción de la CE está directamente asociada con enfermedades vasculares, la insuficiencia renal crónica, trombosis venosa grave patógeno infecciones. Además, CE casi siempre están implicadas en autoinmunidad órgano-específicas como diabetes mellitus o esclerosis múltiple 3. La función de barrera entre la sangre y órganos por lo tanto es controlada por una interacción concertada de diferentes tipos de células. En el músculo esquelético microvascular células endoteliales (MMEC) junto con las células musculares, fibroblastos y pericitos forman una unidad funcional, la "unidad myovascular" (MVU). Por lo tanto, una disfunción de la MVU pudo desempeñar un papel fundamental en la fisiopatología de las Miopatías. Sin embargo, una comprensión más profunda de estos mecanismos reguladores todavía falta y actualmente imposibilita la identificación de objetivos nuevos, urgentes, terapéuticos en las Miopatías.

Para investigar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos complejos, se utilizan modelos animales. Sin embargo, en vitro modelos ofrecen la ventaja de centrarse en el tema de interés mediante la exclusión de una gran variedad de factores de confusión. Para investigar los procesos in vitro es necesario aislar células primaria puras y viables. En contraste con las líneas celulares, células primarias aisladas de animales transgénicos permiten investigar las consecuencias de modificaciones genéticas in vitro.

Aquí, un método para aislar primaria MMEC murino se describe mediante el uso de disociación mecánica y enzimática, seguida de magnético celular activado clasificación técnicas (MCS) para la purificación. Para ello, se utilizan granos magnéticos contra marcadores de superficie específicos. Plaquetas endotelial de la célula molécula 1 de adhesión (PECAM1, CD31) se expresa principalmente en el CE y se puede utilizar para enriquecer este tipo celular. Para garantizar la pureza alta de la célula, las células de origen hematopoyético son excluidas por una selección negativa para la proteína tirosina fosfatasa receptor tipo C (PTPRC, CD45). Además, se presentan los controles de calidad, el cultivo de primaria MMEC murino, aplicaciones potenciales y limitaciones, así como consideraciones especiales.

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Protocolo

Todos los experimentos en animales eran aprobados por las autoridades locales y llevó a cabo conforme a la ley de bienestar animal alemán (84-02.05.20.13.097).

1. general observaciones en animales de experimentación

  1. Todos los experimentos de ratón siguiendo las directrices de la respectiva atención animal institucional y Comité.
  2. Mantener los ratones en condiciones estandarizadas y de acuerdo con las normas internacionales como la Federación de laboratorio animales ciencia asociaciones (personal).
    Nota: En general puede utilizarse esta técnica de aislamiento para los ratones independientemente de la edad, el género o la genética. Para obtener un número suficiente de células, 4 – 10 semanas de edad los machos se prefieren, porque propiedades biológicas pueden variar con la edad y género.

2. preparación de soluciones, medios de comunicación y la capa

  1. Preparar la solución de digestión (DS) mediante la mezcla de 2, 2 mL de Dulbecco´s modificado Eagle Medium (DMEM) con 200 μL Dispase colagenasa y 45 μL Desoxyribonuclease (DNasa).
  2. Preparar 500 mL de medio (ECM) de la célula endotelial mezclando 450 mL de DMEM con FCS de 50 mL (10% aproximadamente), 0.25 mL bFGF de factor de crecimiento básico del fibroblasto (20 μg/mL, aproximadamente 0.05%) y 5 mL penicilina-estreptomicina (aproximadamente 1%). Realizar la filtración estéril en un tubo de vidrio (diámetro de los poros del filtro: 0.2 μm). Luego almacenar la solución a 4 ° C.
  3. Placas de cultivo de células de la capa como se describe a continuación.
    1. Para el cultivo de cubierta del MEC murino primaria recién aislado toda la superficie con 1 mL por pozo de 6 celulares bien placa de cultivo con una solución de recubrimiento de gelatina base velocidad (véase Tabla de materiales) según instrucciones del fabricante de 3 a 5 minutos en la sala de temperatura (RT).
    2. Aspirar y descartar la solución de recubrimiento. Lave cada pocillo con 2 mL tamponada de fosfato estéril solución salina (PBS), pH 7.1, 7.5 en dos pasos consecutivos de lavado.
    3. Aspirar y descartar el PBS. Llenar los pozos con volumen de 1 mL de ECM.

3. aislamiento de células endoteliales microvasculares principal músculo murino (MMEC)

  1. Eutanasia a un adulto 4 – 12 semanas ratón viejo, hombre por dislocación cervical sin ninguna anestesia. El objetivo es separar rápidamente la médula espinal desde el cerebro con el fin de proporcionar al animal una muerte rápida e indolora.
  2. Cortar las extremidades.
    1. Utilizar un quirúrgica sharp/blunt (borde de corte de 42 mm, recto) y sharp/sharp (vanguardia 23 mm, recta) tijera recta (serrada, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) y una curva (serrado, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) fórceps.
    2. Desinfecte todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.
    3. Coloque el animal en su espalda, humedecer las piernas con etanol al 70%. Cortar la pierna entera por corte en la articulación de la cadera con la tijera quirúrgica sharp/blunt. Colocar las extremidades en una placa de cultivo de célula cerrada (35 x 10 mm).
      Nota: De ahora en adelante realizar cada paso bajo campana de flujo laminar estéril y con instrumentos esterilizados.
  3. Aislar del tejido muscular (preferentemente usar el cuadriceps de musculus femoris o surae del tríceps de musculus de ambas piernas).
    1. Cortar la piel abierta de la cadera hasta la punta del dedo del pie mediante un afilado/afilado tijeras y pinzas curvas. Sostenga el dedo del pie o bandolero con el fórceps recto. Pele la piel con el fórceps curvado desde el dedo del pie a la cadera.
    2. Aislar el cuadriceps de musculus femoris cortar el tendón de la rodilla y separa el músculo a lo largo del fémur a la cadera. Aislar el musculus triceps surae por cortar el tendón de Aquiles. En adelante, corte a lo largo de la tibia a la fosa poplítea y retirar el músculo.
      Nota: Si grandes vasos (femoralis de a. a. tibial anterior, a. tibial posterior, a. fibularis) son visibles en los músculos aislados, retire los recipientes para evitar la contaminación por endotelio macrovasculares.
    3. Para quitar los recipientes grandes, sujete la parte del músculo que no contiene vasos con un fórceps curvo y cortar al lado de la nave. De este protocolo, se recomienda 1 g o menos tejido muscular igual al cuádriceps femoral y triceps surae .
    4. Añadir μl 2.445 DS (del paso 2.1) en una placa de cultivo celular (35 x 10 mm) y determinar el peso.
    5. Transferir todos los pedazos de músculo a este plato de cultivo celular que contiene el μl 2445 DS y determinar el peso. La diferencia de ambos valores medidos proporciona el peso seco de tejido muscular que no debe exceder de 1 g.
    6. Cortar el tejido de músculo entero en trozos pequeños (≤ 2 mm cubos, cerca de 100 piezas) mediante el uso de la tijera aguda/aguda.
  4. Disociar el tejido muscular.
    Nota:     este paso toma unos 120 minutos.
    1. Suspensión de músculo/DS tienda a 37 ° C (incubadora con 5% CO2) por 1,5 h. mezclar la suspensión cuidadosamente cada 20 min durante unos 5 minutos utilizando una jeringa de insulina 1 mL.
    2. Transferir la suspensión a 70 μm nylon celular colador colocado sobre un tubo de 50 mL y recoger el flujo a través. Lave el filtro celular con 8 mL de DMEM y recoger el flujo a través.
    3. Descartar la suspensión celular del colador y centrifugar 10 min a 300 x g a 20 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante.
      PRECAUCIÓN: pellet es fácil de perder.
    4. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de un tampón de lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) (véase la adjunta Tabla de materiales) para la lisis de glóbulos rojos e incube durante 30 s RT. Añadir 9 ml de DMEM + 10% FCS para detener la suspensión de células de reacción y transferencia para una t de 15 mL UBE.
  5. Agotan CD45+ siguiendo las instrucciones del fabricante de microesferas de CD45 de las células. Para todos los siguientes pasos de CD45+ agotamiento usar tampón MCS (ver adjunto tabla de materiales).
    Nota:     este paso tarda unos 60 minutos.
    1. Determinar el número de células con una célula de Neubauer recuento de cámara (esperar aproximadamente 5 x 106 células por g de tejido muscular).
    2. Suspensión de centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Despegar totalmente de sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 90 μl de tampón de MCS (por 107 células o menos). Añada 10 μL de microesferas de CD45 (por 107 células o menos).
    3. Mezclar la suspensión de células e incubar durante 15 min en la nevera a 4-8 ° C.
    4. Añadir 1mL de tampón de MCS (por 107 células o menos). Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite completamente el sobrenadante y resuspender las células en buffer MCS de 500 μL.
    5. Para la separación magnética de células utilizar una columna magnética grande (LMC) con un volumen de embalse de 8 mL y una capacidad de hasta 2 x 109 células totales. La posición en el campo magnético del separador de la LMC.
    6. Lavar con 3 mL de tampón de MCS en el depósito de la LMC. Después de enjuagar, colocar un tubo cónico de 15 mL por debajo de la columna para recoger el flujo a través. Aplicar la suspensión de células enteras (500 μl) sobre la columna y dejar totalmente flujo a través.
    7. Lavar la columna tres veces mediante la adición de 3 mL de tampón de MCS en el depósito y esperar a que el embalse de column´s está vacío antes de realizar el siguiente paso de lavado.
    8. Recoger las células sin etiqueta pasando la columna utilizan para seguir los pasos de separación (que representa el CD45 fracción– ). Etiquetado células (representando el CD45+ fracción) acumulados en la columna puede ser desechada.
  6. Se acumulan CD31+ las células siguientes CD31 microbeads del fabricante. Para todos los siguientes pasos de CD31+ acumulación utilizan búfer MCS.
    Nota:     este paso tarda unos 60 minutos.
    1. Determinar el número de celular utilizando una celda de Neubauer recuento de cámara (esperar aproximadamente 4 x 106 células por g de tejido muscular).
    2. Centrífuga obtenido suspensión de células sin etiqueta de paso 3.5 por 10 min a 300 x g a 4 ° C.
    3. Quite completamente el sobrenadante. Resuspender el precipitado en tampón MCS de 90 μL y añadir 10 μL de microesferas de CD31 (por 107 de células totales o menos). Mezclar la suspensión entera e incubar durante 15 min en la nevera a 4-8 ° C.
    4. Añadir 1mL de tampón de MCS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de tampón MCS.
    5. Para la separación magnética de células utilizar una columna magnética media (MMC) con un volumen de embalse de 3.5 mL y una capacidad de hasta 2 x 108 células totales.
    6. Coloque el MMC en el campo magnético del separador. Enjuague el MMC con 500 μl de tampón MCS. Después de enjuagar, colocar un tubo cónico de 15 mL por debajo de la columna para recoger el flujo a través.
    7. Aplicar la suspensión de células enteras (500 μl) sobre la columna y dejar totalmente flujo a través.
    8. Lavar la columna tres veces al agregar 500 μl de tampón MCS y espere hasta que el depósito de la primera columna está vacía antes de realizar el siguiente paso de lavado. Las células pasando la columna representan el CD45– CD31 fracción– . Guárdelo para más controles de calidad.
    9. Retire el separador de columna y colóquelo en un tubo de recogida (tubo 15 mL). Pipeta 2 mL MCS de tampón sobre la columna. Limpie inmediatamente las células magnéticamente etiquetado empujar firmemente el émbolo en la columna. Este CD45– CD31+ fracción representa a la EC murino primario enriquecido
    10. Suspensión de células de centrifugar 5 min a 350 x g a 20 ° C. Quite completamente sobrenadante y resuspender las células (esperar alrededor de 0.6 x 106 células por g de tejido muscular) en 1 mL de ECM (vea el paso 2.2.). Transferencia (0,5 – 0,7 x 106 células) a un único pozo de una placa de cultivo de 6 pozos recubiertos (del paso 2.3) que contiene 1 mL de ECM.
  7. Para el cultivo, se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril. Actualizar el ECM cada dos o tres días.

4. primaria MMEC murino purificación

  1. Realizar un segundo ciclo de CD31+ acumulación, siguiendo las instrucciones del fabricante (CD31 microbeads protocolo del ratón; vea paso 3.6.).
    1. Separar las células con solución de tripsina/EDTA cuando están en 80-90% de confluencia (generalmente después de 7 días). Para ello, lavar cada pocillo con 2 mL de PBS estéril, en dos pasos consecutivos de lavado. Utilizar solución de tripsina/EDTA de 800 μL por pocillo 6 e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril por 3 a 5 minutos parada de actividad enzimática utilizando 1200 μL DMEM con un mínimo de 10% FCS.
    2. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 350 x g a 20 ° C.
    3. Realizar el segundo paso de CD31-MCS para aumentar la pureza (de acuerdo a las instrucciones de CD31 microbeads manufacturer´s; ver 3.6.).
    4. Observar células confluencia vía campo brillante o estándar de contraste de fase microscopio usando un
      20 aumentos y apertura numérica de la lente 0.35. Vea la figura 1.
      Nota: Las células pueden ser utilizadas para experimentos respectivos o mantenidas en cultivo por pases. Utilizar células para experimentos puntualmente en pasos inferiores. Se recomienda no utilizar las células después de paso
      8 – 10.

5. Control de calidad

  1. Realizar citometría de flujo de MMEC murino primaria después del segundo paso de MCS CD31.
    1. Preparar un tubo de FACS agregando 1 mL flujo cytometry (FC) de tampón (ver adjunto Tabla de materiales).
    2. Separar las células con solución de tripsina/EDTA cuando están en el 100% de confluencia (generalmente después de 14 días). Para ello, lavar cada pocillo con 2 mL de PBS estéril, en dos pasos consecutivos de lavado. Utilizar solución de tripsina/EDTA de 800 μL por pocillo 6 e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril por 3 a 5 minutos parada de actividad enzimática utilizando 1200 μL DMEM con 10% FCS.
    3. Determinar el número de celular utilizando un Neubauer recuento celular cámara y añadir un mínimo de 1 x 105 células en el tubo preparado de FACS.
    4. Suspensión de células de centrifugar 10 min a 300 x g a 4 ° C. Realizar dos pasos de lavado eliminando el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL FC de tampón y centrifugar 10 min a 300 x g a 4 ° C.
    5. Preparar una mezcla de tinción mediante la adición de anti-ratón CD31-FITC anticuerpo (1: 100) y anti-ratón CD45-PE (1: 100) con tampón de FC.
    6. Resuspender las células en 100 μL de la mezcla en los tubos de la FACS de la coloración. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Añadir 1 mL de tampón FC. Suspensión de células de centrifugar 5 min a 300 x g a 4 ° C. Con cuidado quite el sobrenadante y resuspender las células en 200 μL de tampón FC.
    7. Medida de células en un citómetro de flujo siguiendo la estrategia bloquea se muestra en la figura. 2A.
  2. También puede realizar inmunofluorescencia tinción de MMEC murino primaria después del segundo paso de MCS CD31.
    1. Capa el cubreobjetos.
      1. La transferencia estéril de 13 mm de diámetro redondo cubreobjetos de cristal en un pozo de una placa bien 24. Cubreobjetos de capa añadir 300 μL de solución de recubrimiento de velocidad por pozo. Incubar durante 3 – 5 min a temperatura ambiente (RT).
      2. Aspirar y descartar la solución de recubrimiento. Lave cada pocillo con 2 mL de PBS estéril en dos pasos consecutivos de lavado. Aspirar y descartar el PBS.
      3. Semilla 1 x 105 células en 1 mL de ECM en el cubreobjetos recubierto e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora estéril hasta que las células son 99% confluente.
    2. Realizar la fijación y tinción de inmunofluorescencia.
      1. Retire el medio ECM de células cultivadas de 5.2.1.3.
      2. Fije las células cultivadas mediante la adición de paraformaldehído al 4% de 300 μL (PFA) con pH de 7.4 por pozo, 10 min a 4° C.
        PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
      3. Realizar 3 pasos de lavado agregando 1 mL de PBS por pozo y sobrenadante después de 5 min a TA.
      4. Preparar un bloqueo solución que contiene 5% BSA, 0.2% Triton-X y el 1% de suero de cabra en PBS.
      5. Añadir 300 μL de solución de bloqueo a cada pozo e incubar 1 h a TA.
      6. Quite el sobrenadante y agregar 200 μL por pocillo de un anti-PECAM-1 (CD31) anticuerpo (1: 200) en 5% BSA, suero de cabra de 1% en PBS e incubar a 4 ° C durante la noche.
      7. Realizar 3 lavado pasos agregando 1 mL de PBS por bien y eliminar sobrenadante después de 5 min a temperatura ambiente en cada paso.
      8. Preparar una solución de anticuerpo secundario conjugado con Cy3 anti-rata IgG del anticuerpo (1: 500) en 1% de BSA y PBS. Añadir 300 μL por pocillo de la solución de anticuerpo secundario e incubar 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
      9. Realizar 3 lavado pasos agregando 1 mL de PBS por bien y eliminar sobrenadante después de 5 min a temperatura ambiente en cada paso.
    3. Sacar con cuidado el cubreobjetos de vidrio redondo con pinzas y ponerlo sobre un portaobjetos de microscopía. Agregue una cantidad apropiada de DAPI que contiene medio de montaje sobre la capa de células y cuidadosamente puso un cubierta de vidrio (véase adjunto Tabla de materiales).
    4. Observar las células con un microscopio de fluorescencia adecuado equipado con una fuente de luz de fluorescencia (120 W) y dos conjuntos de filtro: un filtro de excitación/emisión de conjunto con 550/25 nm y longitudes de onda de nm 605/70 para detectar Cy3 540/562 nm.
    5. Utilizar un segundo filtro con una longitud de onda de excitación/emisión de 365/50 nm y 445/50 nm para detectar DAPI 350/440 nm. Usar un aumento de x 40 y 80% de intensidad de 14.5 mW/cm2 para DAPI con una duración de la adquisición de 30 ms. para la detección de Cy3 uso 80% de 67,5 mW/cm2 con una duración de la adquisición de 60 ms.
  3. Realizar PCR cuantitativa.
    1. Aislamiento del mRNA.
      1. Siga los procedimientos estándar mediante un reactivo de ácido Guanidinio tiocianato-fenol (AGTP) para aislar mRNA. Utilizar un mínimo de 0.5 x 106 células CD45– CD31– (ver paso 3.6.8), CD45– CD31+ (ver paso 3.6.9.) fracciones y cultivada MMEC murino primaria (4.1.3)
      2. Suspensión de células de centrifugar 10 min a 300 x g a 20 ° C. Sacar completamente el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de suspensión AGTP reactivo y la transferencia de células en un tubo de ensayo 2 mL. Incubar por 5 min a TA.
      3. Añada 100 μl de cloroformo y agite vigorosamente por 15 s. Incubar 3 min a TA.
      4. Suspensión de la centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      5. Despegar la parte superior fase acuosa (que contiene RNA) cuidadosamente y transferir a un tubo de reacción de 1,5 mL. Añadir 250 μl de isopropanol e incubar 10 min a TA.
      6. Realizar un paso de centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
      7. Quite el sobrenadante y agregar cuidadosamente 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
        Nota: Pellet es fácil de perder.
      8. Quite completamente el sobrenadante. Que el sedimento seco en el aire 5-10 minutos.
        Nota: etanol debe eliminarse pero no no se seque demasiado.
      9. Disolver el pellet en 30 μL diethylpyrocarbonate tratar agua que contiene en y calentar 10 min a 55 ° C.
        Nota: Pureza y concentración del RNA se pueden medir por un espectral-fotómetro.
    2. Realizar síntesis de cDNA (polimerización en cadena de la transcriptasa reversa).
      1. Preparar un mastermix que contiene: 10 μl de tampón PCR (5 x), 2,5 μl desoxyribonucleosid-trifosfato (dNTP (10 mM)), mezcla al azar de 0,5 μl de primer monocatenario (0,2 μg / μl), 1 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U / μl, 0.4 reversa transcriptasa (200 U/μL) y 5.6 μl de diethylpyrocarbonat agua tratada (ver adjuntada tabla de materiales).
      2. Diluir 500 ng RNA en 30 μl de agua tratada diethylpyrocarbonate en 0,2 mL tubos de PCR y añadir el mastermix entero de 20 μl.
      3. Utiliza un ciclador PCR realizando siguiendo pasos: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C y mantener a 4 ° C.
  4. Realizar PCR cuantitativa (qPCR).
    Nota: Realizar qPCR de muestras en duplicado o triplicado.
  5. Usar imprimación con dos tintes diferentes fluorescencia. Cartilla con una absorción de 495 nm y una emisión de 517 nm para el gen de interés.
  6. Para la detección de la expresión de genes del marcador de célula satélite, uso de cebadores para la proteína de sincronizado caja 7 (Pax7) y M-cadherin (Cdh15) (véase la adjunta Tabla de materiales).
  7. Para la detección de la expresión de genes marcadores de células endoteliales, usar primers de claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) y zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO1) (ver adjuntada tabla de materiales).
  8. Gen de referencia para el 18s rRNA, utilizar una cartilla con la absorción de 538 nm y una emisión de longitud de onda nm 554.
  9. Preparar un mastermix de qPCR para cada gen de interés, con la cartilla respectiva. Mastermix contiene: 10 μl buffer de qPCR (x 2), 1 μl de cebador para el gen de interés (10 μm), 1 μl de cebador para 18s rRNA y 4 μL de nucleasa agua libre.
  10. Añadir 16 μl del mastermix a un único pozo de una placa de 96 pocillos de reacción. Añadir 4 μL de cDNA (Obtenido de paso 5.3.2.) por que también contiene el mastermix.
  11. Utiliza un ciclador PCR en tiempo real realizar siguiendo pasos: holding etapa con 50 ° C por 2 min y 95 ° C durante 10 minutos etapa de ciclismo con 40 ciclos de 95 ° C 15 s y 60 ° C durante 1 minuto.

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Resultados

Un día después de aislamiento, principal MMEC murino y residual otras células forman conglomerados y se adhieren a la parte inferior de los platos de la cultura (figura 1A día 1). Del día 7, se pueden observar células alargadas y planas. Sin embargo, la contaminación de otros, sobre todo células del esferoide, es aún visible (figura 1A día 7). Así, otro ciclo de CD31 positiva selección vía MCS se requiere. En adelante, p...

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Discusión

Las células endoteliales microvasculares proporcionan funciones de barrera en todos los tejidos y los resultados de la disfunción en la enfermedad de los órganos asociados 3. Por otra parte, estudios de órgano-específicas de la CE microvascular podrían allanar el camino para nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la función microvascular de CE bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es de gran interés científico. Modulación de la interacción leucoci...

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Divulgaciones

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el "Else Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 TR), "Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster" (I-RU211811 a TR) y la Fundación alemana de investigación (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 y ME 3283/6-1 a las SGM). Ilustrado imágenes proporcionadas por Heike Blum.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% Tripsina-EDTAThermo Fisher25200-056
tampón150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA en agua a un pH de 7,3
Anti-ratón CD31-FITC (clon MEC13.3)Biolegend102506Control de isotipos: FITC Rata IgG2a, κ Isotipo Ctrl
Anti-ratón CD45-PE (clon 30-F11)Biolegend103106Control de isotipos: PE Rata IgG2b, κ Isotipo Ctrl
bFGFPeprotech100-18BFactor de crecimiento básico de fibroblastos
BSASigma AldrichA4503
CD31 MicroBeads ratónMiltenyi Biotec130-097-418
CD45 MicroBeads ratónMiltenyi Biotec130-052-301
colagenasa-dispasaRoche10269638001Colagenasa de V. alginolyticus, Dispasa de B. polymyxa
Corning Costar Placas múltiples de 6 pocillos tratadas con TC Corning3516
Cy3 anticuerpo IgG anti-rata conjugado con Cy3dianova712-166-153
DAPI (Reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI)Thermo FisherP36935
DesoxirribonucleasaSigma AldrichD4513Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino
Agua tratada con dietilpirocarbonatoThermo FisherAM9916
DMEM, que contiene suplemento de glutamina y piruvatoThermo Fisher31966-021calentar hasta 37 ° C antes de usar
dNTP Mix (10 mM)Thermo FisherR01921 mL
EDTASigma AldrichE5134
Tubos FACSSarstedt551,579
Falcon 70 μ m Filtro de célulasCorning352350
FC tampón0,1% BSA, 0,2% NaN3, 2 mM EDTA
Suero fetal para ternerosSigma AldrichF6178Suero fetal para terneros
Tinte de viabilidad fijable eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
Pinzas (dentadas, rectas, 12 cm)Fine Science Tools11002-12
Pinzas (dentadas, rectas, 12 cm)Fine Science Tools11009-13
Jeringa de insulina 100 Solo 1 mL (Omnifix)Braun9161708V
columnas magnéticas grandes (columnas LS)Miltenyi Biotec130-042-401
MCS0,5% BSA, 2 mM EDTA en PBS a un pH de 7,2
Columna magnética media (columna MS)Miltenyi Biotec130-042-201para CD31-MACS-step
Agua libre de nucleasasThermo FisherR0581
PBS Sigma AldrichSolución salina tamponada con fosfato, lista para usar
Tampón PCR (5x)Thermo FisherEP0742en un kit con la transcriptasa inversa
Pecam1 rata α-ratónSantaCruzSc-52713100 µ g/mL
Penicilina-EstreptomicinaSigma AldrichP4333
células musculares murinas primariasCelprogen66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)Thermo FisherMm00483191_m1FAM
etiquetado Primer Cldn5 (claudin-5)Thermo FisherMm00727012_s1FAM
etiquetado Primer Ocln (ocludin)Thermo FisherMm00500912_m1Imprimación etiquetada con FAM
Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1Imprimación con etiqueta FAM
Tjp-1 (Zonula occludens 1)Thermo FisherMm00493699_m1FAM con
Primer 18s rRNA (control endógeno eucariota)Thermo Fisher4310893Emarcado con VIC
(Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 x 1,25 mL; para 200 reacciones cada una
Mezcla aleatoria de cebador monocatenarioThermo FisherSO142Random Hexamer Primer
Transcriptasa inversa (200 U/μ L) + tampón PCR (5x)Thermo FisherEP0742
Inhibidor de la Rnasa (40 U/μ L)Tijera Thermo FisherEO0381
(filo de 23 mm, afilado/afilado)Tijera Fine Science Tools14088-10
(filo de 42 mm, afilado/romo)Fine Science Tools14001-13
Speed Coating solutionPeloBiotechPB-LU-000-0002-00
ACK listo para usar para tampón CD45-MACS-step Tampón qPCR

Referencias

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