Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.
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Artículo de método
Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase
En este artículo
Resumen
Resumen
Radiactivos de Pulso-persiga el etiquetado es una poderosa herramienta para el estudio de la maduración conformacional, el transporte y su localización celular funcional, la degradación de las proteínas de la blanco en células vivas. Mediante el uso de tiempos radiolabeling cortos (pulso) (< 30 min) y firmemente controlada por tiempos de persecución, es posible que sólo una pequeña fracción de la piscina de la proteína total de la etiqueta y seguir su plegamiento. Cuando se combina con nonreducing, reduciendo electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la inmunoprecipitación con anticuerpos (específicos de conformación), procesos de plegamiento puede examinarse con gran detalle. Este sistema se ha utilizado para analizar el plegado de proteínas con una gran variación de propiedades como proteínas solubles, proteínas transmembranales únicas y de multipaso, pesadamente proteínas N - y O-glicosiladas y proteínas con y sin extenso disulfuro de la vinculación. Pulso-persiga los métodos son la base de estudios cinéticos en una gama de características adicionales, incluyendo co - modificaciones del posttranslational, Oligomerización y polimerización, esencialmente, lo que permite el análisis de una proteína desde el nacimiento hasta la muerte. Pulso-persiga los estudios en el plegamiento de la proteína son complementarios con otros métodos bioquímicos y biofísicos para el estudio de proteínas en vitro proporcionando información fisiológica y mayor resolución temporal. Los métodos como se describe en este artículo se adaptan fácilmente para estudiar el plegamiento de casi cualquier proteína que puede expresarse en sistemas mamíferos o insectos-cell.
Introducción
El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes1. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.
El metabólico etiquetado de proteín....
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Protocolo
Todos los procedimientos y reactivos radiactivos se manejaron con arreglo a las normas y reglas locales de radiación de la Universidad de Utrecht.
1. pulso Chase
-
Pulso Chase para células adherentes
Nota: Los volúmenes dados aquí se basan en platos de cultivo celular 60 mm. Para 35 mm o 100 mm platos, multiplicar los volúmenes por 1/2 o 2, respectivamente. Este protocolo utiliza un tiempo de pulso de tiempos de 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min 10 min y chase. Estos pueden variar dependiendo de las proteínas específicas estudiadas (discutidas abajo).- Las células adherentes (por ejemplo, HEK 293, HeL....
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Resultados
El plegamiento y la secreción de la gp120 del VIH-1 de una persecución de pulso adherente se muestra en la figura 2. El gel nonreducing (Nº de células en la figura) muestra el plegamiento oxidativo de gp120. Inmediatamente después del pulso de etiquetado de gp120 de 5 min (min 0 chase) aparece como una banda difusa en el gel, y conforme avanza la persecución, la banda migra por el gel a través de la aún más difundida plegamiento intermedios (IT) hasta que se .......
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Discusión
Pulso-persiga métodos han sido esenciales para el desarrollo de la comprensión de los científicos del plegamiento en las células intactas de la proteína. Mientras que hemos intentado ofrecer un método que es tan general como sea posible, este enfoque tiene el potencial de las variaciones casi ilimitadas estudiar varios procesos que ocurren durante el plegamiento, el transporte y la vida de las proteínas dentro de la célula.
Cuando se realiza una persecución de pulso utilizando células adherent.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores gracias a todos los miembros del laboratorio Braakman, pasado y presentan, para sus discusiones fructíferas y ayudan en el desarrollo de los métodos presentados en este artículo. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en séptimo programa marco (FP7/2007-2013) N ° de la Unión 235649 y la organización de países bajos de investigación científica (NWO) bajo el eco-programa N ° 711.012.008.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga safeseal de 1,5 mL Sarstedt | 72.706.400 | ||
| Ácido acético | Sigma | A6283 | acético glacial |
| BAS Pantalla de fósforo de almacenamiento 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Azul de bromofenol | Sigma | B8026 | Grado de biología molecular |
| Películas Carestream Biomax MR | Kodak Z350370-50EA | ||
| Medios de cultivo celular | Varios | N/A | Medios de cultivo celular normales para líneas celulares específicas utilizados |
| Medios de cultivo celular, sin metionina/cisteína | Varios | N/A | Misma formulación de medios que los medios de cultivo normales, por ejemplo, DMEM/MEM/RPMI, sin metionina ni cisteína |
| Papel de filtro de carbón vegetal | Whatman | 1872047 | |
| Puntas de pipeta filtradas con carbón vegetal | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Protector de vacío para carbón | vegetal Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | para electroforesis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Grado de biología molecular, Hacer 500 mM de stock, almacenar en -20 |
| Ditiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Grado de biología molecular |
| EasyTag Express35S Mezcla de etiquetado de proteínas | Perkin Elmer | NEG772014MC | Otros tamaños de etiquetas están disponibles según el uso. |
| EDTA | Sigma | E1644 | Grado de biología molecular |
| Equipo de secado en gel | Varios | N/A | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | Papel |
| cromatografía de grado 3 | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Grado de biología molecular |
| Metanol | Sigma | MX0490 | |
| Metionina | Sigma | M5308 | Grado de biología molecular, haga 250 mM de caldo, almacene a -20 |
| Minigel equipo de fundición/funcionamiento | Varios | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Grado de biología molecular |
| N-etilmaleimida Sigma | E3876 | Grado de biología molecular, haga 1M de stock en etanol 100%, almacene a -20 | |
| PBS | Sigma | P5368 | Grado de biología molecular |
| Proteína-A Perlas de flujo rápido de sefarosa | GE cuidado de la salud | 17-5280-04 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma | L3771 | Grado de biología molecular |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Grado de biología molecular |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Grado de biología molecular |
| Typhoon IP Generador de imágenes biomoleculares | Amersham 29187194 | ||
| Bastidor de tubos de ensayo sin cables de 20 mm para baño de agua | Nalgene | 5970-0320PK |
Referencias
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
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Reimpresiones y permisos
