Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

Resumen

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Resumen

La quinasa de repetición rica en leucina 2 (LRRK2) es el gen mutado con más frecuencia en la enfermedad hereditaria de Parkinson (PD) y todas las mutaciones patógenas de LRRK2 resultan en la hiperactivación de su función quinasa. Aquí, describimos un ensayo fácil y robusto para cuantificar la actividad de la vía quinasa LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica humana midiendo la fosforilación controlada por LRRK2 de uno de sus sustratos fisiológicos, Rab10 en la threonina 73. El análisis de inmunoblotting descrito requiere un anticuerpo totalmente selectivo y fosfoespecífico que reconozca el epítopeno Rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10. Utiliza neutrófilos de sangre periférica humana, porque la sangre periférica es fácilmente accesible y los neutrófilos son un componente abundante y homogéneo. Es importante destacar que los neutrófilos expresan niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10. Un inconveniente potencial de los neutrófilos es su alta actividad intrínseca de proteasa de serina, que requiere el uso de inhibidores de la proteasa muy potentes como la neurotoxina organofosfora diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte del tampón de lisis. Sin embargo, los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la actividad in vivo de la vía quinasa LRRK2 y deben considerarse para su inclusión en las colecciones de biorrepositorios de DP.

Introducción

Los intentos de reducir o detener la enfermedad de Parkinson (PD) han fracasado hasta ahora. El descubrimiento de mutaciones hiperactivadoras en la quinasa repetitiva rica en leucina 2 (LRRK2) que causan y/o aumentan el riesgo de DP ha llevado al desarrollo de inhibidores de la quinasa LRRK2^1,,2,,3. Estos han entrado ahora en ensayos clínicos⁴. La función exacta de LRRK2 no está clara, pero un avance importante ha sido la identificación de un subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluyendo Rab10, como los primeros sustratos fisiológicos de buena fe de ....

Protocolo

Según la normativa local del Reino Unido, todas las manipulaciones y pipeteos de sangre humana se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de categoría 2. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la junta local de revisión ética y todos los participantes han dado su consentimiento informado.

1. Preparación

1. Preparar 0,1 ml de EDTA Stock Solution 1 que contiene 100 mM edtA en solución salina con búfer de fosfato (PBS).
2. Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 que contiene 1 mM de EDTA en PBS.
3. Preparar el tampón de lisis que contenga 50 mM Tris-HCl (pH a 7,5), 1% (v/v) Triton X-100,....

Resultados

Nuestro ensayo permite interrogar la activación de la quinasa LRRK2 asociada a la PD en neutrófilos de sangre periférica humana con la fosforilación Rab10 dependiente de LRRK2 como una lectura. Los neutrófilos son una población homogénea y abundante de glóbulos blancos periféricos que expresa altos niveles de proteínas LRRK2 y Rab10(Figura 1). La única otra población celular entre las células mononucleares de sangre periférica restantes (PPBCD) con un alto número de copias de ambas proteínas.......

Discusión

La evidencia clínica, genética y bioquímica convincente apunta hacia un papel importante para LRRK2 y, en particular, su función quinasa en la enfermedad de Parkinson⁷. Se han desarrollado inhibidores de la quinasa LRRK2 que están entrando en ensayos clínicos^2,4,12. Como tal, es necesario explotar LRRK2 como biomarcador para la participación objetivo, así como la estratificación del paciente. Nuestro prot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Puntas de pipeta de 1 mL	Sarstedt	70.762	o equivalente
Microtubos de 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001	o equivalentes
de 10 mL Puntas de pipeta	Sarstedt	86.1254.025	o equivalente
10 μ L Puntas de pipeta	Sarstedt	70.113	o
equivalente 15 mL tubo falcon	Cellstar	188 271	o equivalente
200 μ L Puntas de pipeta	Sarstedt	70.760.002	o equivalente
25 mL Puntas de pipeta	Sarstedt	86.1685.001	o
equivalente tubo falcon de 50 mL	Cellstar	227 261	o equivalente
BD Vacutainer Hemogard Cierre Plástico K2-EDTA Tubo	BD	BD 367525	o equivalente
centrífuga Beckman Coulter Allegra X-15R, centrífuga	Beckman		o centrífuga equivalente con rotador de cubo de natación para tubos falcon de 15 mL y 50 mL a velocidad 1000-1200 x g
Cabina de seguridad biológica de categoría 2.
Cóctel de inhibidores de proteasa completo (sin EDTA)	Roche	11836170001
DIFP (diisopropilfluorofosfato)	Sigma	D0879	Prepare una solución madre de 0,5 M en isopropanol tomando precauciones especiales
Dimetilsulfóxido	Sigma	6250
Hielo seco o nitrógeno
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	ThermoFisher	14190094	o equivalente
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	para sujetar 1 tubo cónico de 50 ml
Kit de aislamiento directo de neutrófilos humanos EasySep	Stemcell	19666	Contiene soluciones llamadas " Cóctel de aislamiento" y " Perlas magnéticas RapidSpheres
EGTA	Sigma	E3889
Centrífuga Eppendorf 5417R centrífuga	Eppendorf
Etanol, en botella
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma	E6758
Isopropanol de hielo
(grado anhidro)	Tampón de lisis Sigma	278475
(50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosfato, 5 mM pirofosfato de sodio, 0,27 M sacarosa, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol, 1x cóctel de inhibidores de proteasa cOmplete (sin EDTA) (Roche), 1 μ g/ml de microcistina-LR, 0,5 mM de diisopropilfluorofosfato (DIFP).			tampón de lisis congelado alternativamente en alícuotas sin Microcistina-LR, DIFP disponible en reactivos MRC-PPU (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibidor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	o equivalente (potente y selectivo LRRK2 inhinitor)
Microcistina-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock en DMSO y almacenar a -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot sistema de imagen	Odyssey
Rotulador
Equipo
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	o
pirofosfato de sodio	equivalente Sigma	S22
sacarosa	Sigma	S0389
β-glicerofosfato	Sigma	50020
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148
Anticuerpos sugeridos para Western blot
Anticuerpo anti-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-&alfa;-tubulina	Cell Signaling Technologies	5174	utilizado en dilución 1:2000
Cabra anti-ratón IRDye 680LT LI-COR		926-68020	utilizado en dilución 1:10.000
Cabra anti-ratón IRDye 800CW LI-COR		926-32210	utilizado en dilución 1:10.000
Cabra anti-conejo IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	utilizado a una dilución de 1:10.000
MJFF-anticuerpo de ratón Rab10	total generado por nanoTools (nanotools.de)	no aplicable*	utilizado a 2 μ concentración final de g/ml; * El anticuerpo MJFF-total Rab10 generado por nanoTools (www.nanotools.de) [11] será comercializado por la Fundación Michael J Fox en 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	utilizado en 1 μ concentración final g/ml
pS935-LRRK2	MRC PPU Reactivos y servicios	UDD2	utilizado a 1 μ Concentración final g/ml

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