Artículo de método

Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer

DOI:

10.3791/58957

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21 de mayo de 2019

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1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

En este artículo

Resumen

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El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.

Resumen

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Comprender el impacto del microambiente en el fenotipo de las células es un problema difícil debido a la compleja mezcla de factores de crecimiento solubles y proteínas asociadas a la matriz en el microambiente in vivo. Además, los reactivos fácilmente disponibles para el modelado de microambientes in vitro suelen utilizar mezclas complejas de proteínas que están incompletamente definidas y sufren de variabilidad lote a lote. La plataforma de microarray (MEMA) permite evaluar miles de combinaciones simples de proteínas de microambiente por su impacto en los fenotipos celulares en un solo ensayo. Los MEMA se preparan en placas de pozos, lo que permite la adición de ligandos individuales para separar los pocillos que contienen proteínas de matriz de matriz extracelular (ECM). La combinación del ligando soluble con cada ECM impreso forma una combinación única. Un ensayo MEMA típico contiene más de 2.500 microambientes combinatoriales únicos a los que las células están expuestas en un solo ensayo. Como caso de prueba, la línea celular de cáncer de mama MCF7 estaba chapada en la plataforma MEMA. El análisis de este ensayo identificó factores que mejoran e inhiben el crecimiento y la proliferación de estas células. La plataforma MEMA es altamente flexible y se puede ampliar para su uso con otras cuestiones biológicas más allá de la investigación del cáncer.

Introducción

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El cultivo de líneas celulares cancerosas en plástico en monocapas bidimensionales (2D) sigue siendo uno de los principales caballos de batalla para los investigadores del cáncer. Sin embargo, el microambiente está siendo cada vez más reconocido por su capacidad para afectar a los fenotipos celulares. En el cáncer, se sabe que el microambiente tumoral influye en múltiples comportamientos celulares, incluyendo el crecimiento, la supervivencia, la invasión y la respuesta a la terapia1,2. Los cultivos celulares monocapa tradicionales suelen carecer de influencias en el microambiente, lo que ha llevado al desarrol....

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Protocolo

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NOTA: En el diagrama de flujo que se muestra en la Figura 1se describe una descripción general de todo el proceso MEMA, incluido el tiempo estimado. Este protocolo detalla la fabricación de MEMAs en placas de 8 pocillos. El protocolo puede adaptarse a otras placas o portaobjetos.

1. Preparación de tampones de proteínas, diluyentes y tinción

  1. Equilibrar viales de EME, ligandos y citoquinas a temperatura ambiente (RT) y centrífuga brevemente. Agregue el volumen adecuado del búfer RT adecuado como se indica en la hoja de datos del producto. Siga las recomendaciones del fabricante para las....

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Resultados

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Para simplificar los impactos microambientales en el crecimiento y la proliferación celular e identificar las condiciones que promovieron o inhibió el crecimiento celular y la proliferación, la línea celular de cáncer de mama MCF7 se sembraba en un conjunto de ocho MEMA de 8 pozos como se describe en el protocolo. Este ensayo expuso las células a 48 EME diferentes y 57 ligandos diferentes, para un total de 2736 condiciones microambientales combinatorias. Después de 71 h en cultivo, las células fueron pulsadas con EdU, fi.......

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Discusión

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La importancia de la "dimensionalidad" y el contexto ha sido un factor motivador en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro como herramientas en la caracterización de las células cancerosas a través de su interacción con el microambiente11,y la capacidad de in vitro sistemas de cultura para imitar el entorno in vivo es una fuerza impulsora detrás de la búsqueda de mejorar esos sistemas de cultivo. Los sistemas in vitro, sin embargo, siguen siendo herramientas significativas de la investigaci.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la subvención HG008100 (J.W.G., L.M.H. y J.E.K. de la Biblioteca del Fondo Común de NIH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aushon 2470Aushon BioSystemsSistema robótico Arrayer utilizado en el protocolo
Nikon HCANikonSistema de imagen de alto contenido diseñado en torno al microscopio invertido Nikon Eclipse
Ti BioTek Precision XS Liquid HandlerBioTekrobot de manejo de líquidos utilizado en el protocolo
Trizma solución tampón de clorhidrato SigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
GlicerolSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
Placa de microarray de 384 pocillos, pocillo cilíndricoThermo Fisherab1055
Nunc 8 plato de pocillosThermo Fisher267062
solución de paraformaldehído al 16%Microscopía Electrónica Ciencia15710
BSAFisherBP-1600
Azida de sodioSigmaS2002
Máscara celularSondas molecularesH32713
Click-iTEdU Alexa FluorSondas molecularesC10357
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CM
ECM Colágeno ICultrex3442-050-01ECM
Colágeno Tipo IIMilliporeCC052ECM
Colágeno Tipo IIIMilliporeCC054ECM
Colágeno Tipo IVSigmaC5533ECM
Colágeno Tipo VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Desmoglein 2R & D Systems947-DMECM
E-cadherin (CDH1)R & D Systems648-ECECM
ECM1R & D Systems3937-ECECM
FibronectinaR & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SistemasGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D Systems2846-LUECM
M-Cad (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
Nidogen-1R & D Systems2570-NDECM
Osteoadherin/OSADR & D Systems2884-ADECM
Osteopontina (SPP)R & D Systems1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6ECM
Tenascin CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
VitronectinaR & D Systems2308-VNECM
BiglycanR & D Systems2667-CMECM
DecorinR & D Systems143-DEECM
PeriostinR & D Systems3548-F2ECM
SPARC/osteonectinaR & D Systems941-SPECM
Trombospondina-1/2R & D Systems3074-THECM
BrevicanR & D Systems4009-BCECM
ElastinaBioMatrix5052ECM
FibrilinaLynn Sakai Lab OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Ligando
IL1B RnD_Systems_Own201-LB-005Ligando
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Ligando
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200ligando
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSligando
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020ligando
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005ligando
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010ligando
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050ligando
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Ligando
Wnt5ARnD_Systems_Own645-WN-010Ligando
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286ligando
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01Mligando
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UGligando
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Ligando
IL7 RnD_Systems_Own207-IL-005Ligando
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Ligando
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Ligando
WNT10AGenemed_Own90009Ligando
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Ligando
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100ligando
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010ligando
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010ligando
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010ligando
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020ligando
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050Ligando
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050Ligando
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010Ligando
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050Ligando
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010Ligando
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005Ligando
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020Ligando
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025ligando
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010ligando
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABligando
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100ligando
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050ligando
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010ligando
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010ligando
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010ligando
IL6 RnD_Systems_Own206-IL-010ligando
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010ligando
NRG1RnD_Systems_Own378-SMligando
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025ligando
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025ligando
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010

Referencias

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  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....

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