$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOTA: En el diagrama de flujo que se muestra en la Figura 1se describe una descripción general de todo el proceso MEMA, incluido el tiempo estimado. Este protocolo detalla la fabricación de MEMAs en placas de 8 pocillos. El protocolo puede adaptarse a otras placas o portaobjetos.
1. Preparación de tampones de proteínas, diluyentes y tinción
- Equilibrar viales de EME, ligandos y citoquinas a temperatura ambiente (RT) y centrífuga brevemente. Agregue el volumen adecuado del búfer RT adecuado como se indica en la hoja de datos del producto. Siga las recomendaciones del fabricante para las concentraciones de stock.
NOTA: En el Cuadro 1 y en el Cuadro 2se ofrece una lista completa de los ligandos y eFEC con sus existencias y concentraciones finales. Tanto los ligandos como los EME se utilizan típicamente en la concentración más alta de la gama recomendada por el fabricante que provoca un efecto biológico en los ensayos de cultivo estándar de 2 días. Manipule las proteínas suavemente y en los gabinetes de bioseguridad bajo flujo laminar para evitar la contaminación.
- Incubar viales con balanceo suave a RT durante 1 h. No vórtice proteínas, ya que esto puede hacer que desnaturalicen.
- Proteínas aliquot para almacenamiento a largo plazo de modo que todas las alícuotas sean de un solo uso para evitar la degradación con ciclos repetidos de congelación/descongelación. Almacene las proteínas liofilizadas a -80 oC (a menos que se especifique lo contrario) hasta que sea necesario. Tenga cuidado de recopilar todos los metadatos para futuras referencias, tales como: (i) nombre de proteína, (ii) fecha preparada, (iii) número de lote/lote, (iv) proveedor, (v) número de catálogo, (vi) concentración, (vii) volumen y (viii) preparador.
- Prepare el tampón diluente que contenga 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 y esterilizar filtro. Mantenga este búfer estéril y guárdelo en RT.
- Prepare el tampón de tinción que contenga 2% (p/v) de BSA, 1 mM MgCl2y 0,02% NaN3 en solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar y almacenar a 4oC.
2. Preparación de una placa de origen ECM
- Retire las existencias alícuotas de proteínas ECM que se imprimirán y descongelarán en hielo. Registre todos los números de lote para el seguimiento de metadatos.
- Flick tubos de proteínas descongeladas suavemente para asegurar la resuspensión adecuada y girar hacia abajo en una centrífuga.
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Haga mezclas de impresión ECM (ECM) y un fiduciario fluorescente para ser utilizado por un robot de manipulación de líquidos que creará las placas de fuente aleatorias de 384 pocillos.
NOTA: Las placas de origen de 384 pocillos serán utilizadas por una impresora de matriz de pines táctiles para crear las matrices impresas en 8 placas de pozo.
- Etiquetar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada EPM y el fiduciario.
- Preparar cada EPM combinando 125 l de tampón diluyente (ver paso 1.4) con el volumen adecuado de stock de ECM y llevar la mezcla hasta un volumen total de 250 l con PBS. Las concentraciones finales en cada tubo EPM serán 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol y 100 mM Tris.
- Preparar un fiducial fluorescente disolviéndolo en el tampón apropiado especificado por el fabricante y transferir 250 l a un tubo fiduciario etiquetado.
3. Creación de la placa de origen mediante un manipulador de líquidos
- Diseñe un diseño de placa de 384 pocillos que aleatore las posiciones de los EME y esté optimizado para el cabezal de pasador de impresora de matriz que se está utilizando. Diseñe la colocación del fiducial para que se imprima en la fila 1, columna 1 posición de cada pozo para ayudar en la orientación de la matriz.
NOTA: Se utilizan un total de 14 a 15 réplicas de cada ECM para garantizar datos robustos. Incluya réplicas adicionales de colágeno u otro ECM que produzca un accesorio robusto para evaluar la uniformidad de la unión. El diseño puede necesitar utilizar varias placas de 384 pocillos dependiendo del número de ECM de interés.
- Transfiera los tubos EPM a un manipulador de líquidos, manteniendo los tubos a 4 oC, ya sea con un bastidor de tubo refrigerado o utilizando un robot de manipulación de líquidos ubicado en una cámara fría.
- Usando el software del controlador de líquidos, ejecute un programa para transferir 15 l de cada EPM y el fiduciario a los pozos predesignados dentro de la(s) placa(s) fuente(es) de 384 pocillos.
- Pipet PBS en cualquier pozo no utilizado para aumentar la humedad y proteger contra la desecación durante el proceso de impresión.
NOTA: Vea la Figura 2 para ver un ejemplo de un conjunto de placas de origen de 384 pocillos que está optimizado para una cabeza de 4 x 7 pines e incluye un bloque de colágeno I y PBS.
- Sellar la(s) placa(s) y mantenerla a 4oC hasta que esté lista para imprimir.
4. Impresión de MEMA utilizando un robot de impresión de matriz
NOTA: La siguiente parte del protocolo describe específicamente la preparación y el uso de MEMA para investigar el impacto de diferentes proteínas de microambiente en el crecimiento y proliferación de células MCF7. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar diferentes ligandos, eCM y celdas para estudiar otras líneas de celda y puntos finales de interés.
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Con una impresora de pasador táctil, imprima ECM y puntos fiduciarios en 8 placas de pozo. Imprima múltiples réplicas de cada condición de ECM para garantizar la reproducibilidad.
NOTA: Otros formatos de placas o diapositivas se pueden utilizar para la impresión, pero puede ser necesaria la optimización del búfer para lograr una formación de puntos óptima.
- Imprima los ECM para el MEMA utilizando pasadores de 350 m de diámetro dispuestos en una configuración de cabezal de impresión de 4 x 7. Imprima las matrices en las placas de 8 pocillos como 20 columnas por 35 filas, para un total de 700 puntos. Las matrices más grandes son posibles en estas placas, pero vienen con un equilibrio de efectos de borde aumentados en la unión celular y la tinción.
- Después de imprimir, guarde las placas en un desecador durante un mínimo de 3 días antes de su uso.
5. Creación de placas de tratamiento de ligadas
- Diseñe un diseño de placa de 96 pocillos que incluya ligandos de interés. Para facilitar el tratamiento de muchas placas MEMA a la vez, diseñe esta placa con espaciado que permita el uso de un pipeta multicanal con 4 puntas espaciadas para transferir líquidos entre los pocillos de los MEMA de 8 pocillos y una placa de 96 pocillos.
NOTA: En este protocolo, se utiliza el conjunto completo de ligandos enumerados en el Cuadro 2.
- Descongelar los ligandos en el hielo. Pase brevemente y gire por cada tubo.
- Diluir los ligandos a un stock de trabajo 200x utilizando el búfer recomendado por el fabricante (normalmente PBS).
- Pipet 10 l de cada lintíqueta de 200x en el pozo correspondiente dentro de la placa de 96 pocillos.
- Sellar y almacenar las placas a -20 oC.
NOTA: Haga placas de tratamiento de ligandos en lotes, capturando todos los metadatos para el análisis posterior.
6. Células de cultivo en MEMa
- Bloquee los MEMA durante 20 min con 2 ml por pozo de tampón de bloqueo sin inserción que contenga un 1% de agente de bloqueo sin incrustantes (Tablade materiales)en agua destilada doble (ddH2O).
- Búfer de bloqueo de aspiración y pozos de enjuague triple con PBS. Para evitar la desecación, deje el volumen final de PBS en pozos hasta que esté listo para el revestimiento celular.
NOTA: Es extremadamente útil tener dos trabajadores de banco para los pasos de cultivo celular en MEMa. Un trabajador de banco puede realizar pasos de aspiración, mientras que el segundo realiza pasos de adición. Se recomienda utilizar una tubería multicanal de 1 ml con puntas espaciadas para que coincida con la placa de 8 pocillos para pipeteo y un divisor Y con dos pipetas Pasteur para aspirar múltiples pozos a la vez.
- Semilla 2 x 105 Células MCF7 por pozo en 2 ml del medio medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% suero bovino fetal (FBS).
NOTA: Antes de un experimento COMPLETO de MEMA, realice un experimento de valoración celular para optimizar los números de celda de modo que los puntos MEMA tengan números de celda altos (pero no confluentes) al final de la duración experimental deseada.
- Después de 2 a 18 h de adherencia, aspirar medio y reemplazar con 2 mL de medio de crecimiento reducido (DMEM con 0,1% FBS).
NOTA: En este momento se puede utilizar en este momento un suero reducido (p. ej., 0,1% FBS) o condiciones agotadas por factores de crecimiento para aislar el impacto estimulante de ligandos específicos.
- Descongelar una placa de tratamiento de ligando en hielo. Placa descongelación centrífuga a 200 x g durante 1 min.
- Transfiera 200 ml de medio de cada pocal de la placa de cultivo al pozo adecuado de la placa de tratamiento. Pipet hacia arriba y hacia abajo para mezclar el volumen de ligando con medio y transferir esta mezcla de nuevo al pozo apropiado en la placa MEMA.
- Ligeramente roca a mano y devolver las placas MEMA a la incubadora. Cultivo durante la duración del experimento en presencia de la combinación de ligando/ECM a 37oC y 5% de CO2.
NOTA: Un experimento MEMA típico se ejecuta durante 72 h; experimentos de mayor duración pueden requerir la sustitución de medio y re-tratamiento con ligando.
- Pulse pozos MEMA a 71 h con 100x 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) para una concentración final de 10 m. Incubar en condiciones experimentales con EdU durante 1 h a 37oC y 5% CO2.
NOTA: Otros tratamientos de células vivas también se pueden utilizar en este momento.
7. Fijación y tinción de MEMa
- Después de 72 h y cualquier tratamiento celular vivo, aspirar pozos. Fijar MEMA en 2 mL por pozo de 2% paraformaldehído (PFA) durante 15 min en RT.
- Aspirar PFA. Permeabilizar con 2 ml por pozo de tensioactivo no iónico 0,1% durante 15 min.
- Aspirar el tensioactivo no iónico y lavar con 2 mL por pozo de PBS. Aspirar PBS. Lavar con 2 ml de PBS con 0,05% de polisorbato 20 (PBS-T).
NOTA: La superficie MEMA es hidrófoba, y el no lavarse con PBS-T antes de la incubación de manchas y anticuerpos dará lugar a la formación de vacíos en pozos durante las etapas de incubación y dará lugar a artefactos de tinción.
- Aspirar PBS-T. Agregue reactivos de reacción de detección de EdU. Incubar durante 1 h a RT, balanceándose y protegido de la luz. Después de 1 h de incubación, atemple la reacción con el tampón de temple comercial proporcionado.
NOTA: Los pasos de detección y tinción/anticuerpos de EdU se pueden realizar en 1,5 ml por pozo para reducir el coste.
- Aspirar el tampón de temple y lavar con PBS-T antes de incubar con manchas o anticuerpos.
- Incubar pozos MEMA con anticuerpos contra la histona H3K9me3 (1:1.000) y la fibrilarina (1:400) en tampón de tinción que contenga un 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl2 y 0,02% NaN3 durante la noche a 4oC.
NOTA: Realice valoraciones de anticuerpos para determinar las concentraciones óptimas antes de usarlas en un conjunto completo de MEMA.
- Después de la incubación primaria de anticuerpos o manchas, lave los pozos 2 veces con PBS y una vez con PBS-T.
- Añadir anticuerpos secundarios (nelvón anti-ratón IgG y burro anti-conejo IgG, ambos 1:300) y 0.5 g/mL 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI). Incubar durante 1 h a RT en la oscuridad.
- Lavar los pozos 2veces con 2 mL por pozo de PBS, dejándolos en los últimos 2 ml de PBS.
- Proceda a la toma de imágenes o almacene MEMA manchados para obtener imágenes posteriores en PBS a 4 oC protegidos de la luz.
8. Imágenes de MEMAs
- Imagen MEMA en un sistema de imágenes automatizado con canales de detección fluorescentes adecuados.
- Salida de datos de imagen resultantes a un sistema de gestión de imágenes. Segmente las celdas y calcule los niveles de intensidad utilizando CellProfiler8.
9. Análisis de datos
NOTA: El análisis de datos consiste en la normalización, la corrección de variaciones y la integración de los datos derivados de CellProfiler sin procesar. En este caso, el entorno R con código personalizado se utiliza para realizar todos los pasos. Sin embargo, cualquier entorno estadístico o programa de software se puede utilizar para realizar las acciones equivalentes. Un ejemplo del código personalizado de código abierto para el entorno de R para el análisis está disponible en: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Preprocesar y normalizar los datos de imagen segmentados.
- Determine el recuento de células planas utilizando los núcleos manchados DAPI.
- Auto-gate Intensidad EdU para etiquetar celdas como EdU+. Mida la proliferación usando la proporción de Células EDU+ en cada punto.
- Mediana resumen las manchas citoplasmáticas y las mediciones de morfología nuclear a nivel de punto.
- Realizar la eliminación de la normalización de variación no deseada (RUV) en los datos para mejorar la calidad de los datos9.
NOTA: Este enfoque se aplica a cada señal de intensidad y morfología de forma independiente comouna matriz con matrices utilizando las filas y puntos como las columnas como se describió anteriormente 9.
- Aplique la normalización de loess bivariados a los residuos normalizados del RUV utilizando la columna de fila y matriz de matriz como variables independientes para corregir los efectos espaciales o relacionados con la intensidad.
- Una vez completada la normalización, la mediana resume las réplicas de cada condición de microambiente para la presentación de informes y análisis posteriores.