Medición de la forma y el tamaño de las partículas de lodo activado inmovilizado en Agar con una tubería de Software de código abierto

Resumen

El tamaño y forma de las partículas de lodos activados son parámetros importantes que se miden utilizando diferentes métodos. Errores surgen de muestreo no representativo, imágenes subóptimas y parámetros de análisis subjetivo. Para minimizar estos errores y facilitar la medición, presentamos un protocolo especificando cada paso, incluyendo un oleoducto de software de código abierto.

Resumen

Bioreactores experimentales, tales como ésos tratamiento de aguas residuales, contienen partículas cuyo tamaño y forma son parámetros importantes. Por ejemplo, el tamaño y la forma de flóculos de lodo activado pueden indicar las condiciones en la microescala y afectan también directamente cómo el lodo se instala en un clarificador.

Forma y tamaño de las partículas son ambas medidas misleadingly 'simples'. Muchas cuestiones sutiles, a menudo ignoradas en protocolos informales, pueden surgir cuando el muestreo, la proyección de imagen y análisis de partículas. Métodos de muestreo pueden ser sesgados o no proporcionan suficiente poder estadístico. Las muestras se pueden llevar mal o sufren alteración durante la inmovilización. Las imágenes pueden ser de calidad suficiente; superposición de partículas, profundidad de campo, nivel de ampliación y ruidos varios puede todos producir malos resultados. Mal especificado análisis pueden introducir sesgos, como el producido por segmentación y umbral de imagen manual.

Rendimiento y la asequibilidad son deseables junto con reproducibilidad. Un método asequible, de alto rendimiento permite medición de partícula más frecuente, produciendo muchas imágenes que contiene miles de partículas. Un método que utiliza reactivos de bajo costo, un microscopio de disección común y libremente disponibles análisis software libre permite resultados experimentales repetibles, accesibles, reproducibles y parcialmente automatizado. Además, el producto de dicho método puede ser bien formateado, bien definido y fácil de entender por software de análisis de datos, facilitando datos entre laboratorios y análisis en laboratorio.

Presentamos un protocolo que detalla los pasos necesarios para producir un producto, incluyendo: toma de muestras, la muestra preparación e inmovilización en agar, adquisición de imagen digital, análisis digital de imágenes y ejemplos de generación específicos del experimento figura de la resultados del análisis. También hemos incluido un gasoducto de análisis de datos de código abierto para apoyar este protocolo.

Introducción

El propósito de este método es proporcionar un método bien definido, repetible y parcialmente automatizados para determinar las distribuciones de tamaño y forma de las partículas en biorreactores, especialmente aquellas que contienen los flóculos de lodo activado y gránulos aerobios^{1 , 2}. el fundamento de este método mejorar la accesibilidad, sencillez, rendimiento y repetibilidad de nuestros actuales protocolos internos^3,4, facilitar la medición de partículas de otros, facilitar el intercambio y comparación de los datos.

Hay dos categorías generales de análisis de medición de partículas - métodos directo imágenes e inferenciales mediante tales cualidades como la dispersión de la luz⁵. Aunque métodos inferenciales pueden ser automatizados y tienen gran rendimiento, el equipo es caro. Además, mientras métodos inferenciales pueden determinar con precisión el tamaño equivalente de una partícula⁶, no proporcionan información de forma detallada⁷.

Debido a la necesidad de datos de formas, nos hemos basado nuestro método en la proyección de imagen directa. Aunque existen algunos métodos de proyección de imagen de alto rendimiento, ha requerido tradicionalmente caro hardware comercial o soluciones construido^8,9. Nuestro método ha sido desarrollado para emplear común y asequible hardware y software que, aunque sufren de una reducción en el rendimiento, produce imágenes de partículas mucho más que el mínimo necesario para muchos análisis¹⁰.

No debe especificar los protocolos muestreo importante y los pasos de adquisición de imagen. Otros protocolos pueden especificar pasos manuales que introducen sesgos subjetivos (tales como umbral ad hoc¹¹). Un método bien definido que especifica los pasos de adquisición muestreo, inmovilización e imagen combinados con software de análisis gratuitamente mejorará tanto dentro del laboratorio de imagen análisis y comparaciones entre laboratorios. Un objetivo principal de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo y herramientas que deben conducir a resultados reproducibles de diferentes laboratorios para la misma muestra.

Además de normalizar el proceso de análisis de imagen, los datos producidos por este gasoducto se registran en un archivo bien definidos y bien formateado,¹² adecuado para uso popular datos análisis paquetes^13,14, experimento de relajación análisis específicos (como la generación de la figura de encargo) y facilitar información entre laboratorios.

Este protocolo se recomienda especialmente para los investigadores que requieren datos de forma de partícula, no tienen acceso a los métodos inferenciales, desea desarrollar su propia tubería de análisis de imagen y desea compartir sus datos fácilmente con otros

Protocolo

1. recolectar muestras para análisis de partículas

1. Determinar el volumen de muestra para reactores específicos que se producen suficientes partículas para análisis estadístico¹⁰ (> 500) evitando superposición de partículas.
   1. Asumir que una gama de 0.5 a 2 mL por muestra de licor mezcla es suficiente para las muestras de lodos activados con una sólidos suspendido de licor mezcla (MLSS) entre 250 y 5.000 mg/L.
   2. De lo contrario, preparar tres placas de agar de ensayo con 0.5, 2 y 5 mL de muestra (pasos de 1.2 a 2.7).
   3. Estimar visualmente que (si cualquier) volúmenes de muestra mejor cumplir con los criterios enumerados en el paso 1.1.
   4. Si las partículas se superponen todavía para la muestra de 0,5 mL, repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 con tres muestras de 0,5 mL, diluidas con un agregado 0.5, 1 y 2 mL de tampón fosfato salino para determinar el grado en que una muestra de 0,5 mL debe diluirse antes de paso 2.1.
      Nota: Pasos 1.1 − 1.1.4 deben realizarse solamente una vez por el experimento, o si el reactor contenido cambio tal que medidas no cumplen los criterios enumerados en el paso 1.1.
2. Obtener una muestra representativa de una porción bien mezclada del reactor por acaparamiento ~ 40 mL en un vaso de precipitados o un tubo de centrífuga de 50 mL, mezclar suavemente y verter inmediatamente el volumen de muestra determinado de la cuchara bien mezclada en un tubo de centrífuga de 15 mL. Diluir la muestra, es necesario, según lo determinado por el paso 1.1.4.
   Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y la muestra puede conservarse bajo refrigeración (4 ° C) hasta 48 horas. No congele la muestra.
   PRECAUCIÓN: medio de conservación común (p. ej., formaldehído/formamida) no es adecuado. La gran superficie de la placa, en combinación con el recipiente abierto, calor de la fuente de luz y microscopia potencialmente mal ventilada instalación producir innecesariamente peligrosas condiciones para poco aumento en la calidad de la imagen.

2. preparar las placas de agar de partículas teñidas, inmovilizadas

1. Añadir 5 μl de azul de metileno 1% (p/v) a cada muestra, luego tapa e invierta suavemente al menos 3 veces para mezclar. Permita que las muestras a la mancha de al menos 5 pero no más de 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Preparar aproximadamente 10 mL por muestra de agar 7,5% (p/v) en agua desionizada.
   Nota: El Agar puede producido antes de tiempo y almacenado indefinidamente si esterilizado. Agarosa se puede sustituir, pero no mejora sustancialmente la imágenes.
3. Fundir el agar utilizando un baño de agua o microondas y deje que se enfríe un poco antes de su uso. Asegúrese de que el agar se derrita totalmente y vierte fácilmente. Glóbulos sólidos de agar se manchan diferentemente, produciendo imágenes de mala calidad.
4. Transferir suficiente agar fundido de 7.5% (w/v) al tubo de centrífuga para hacer el volumen total del tubo entre 6,5 y 9 mL.
5. Volver a tapar los tubos de centrífuga e invierta suavemente por lo menos 3 veces para mezclar.
6. Y señalando la tapa lejos de uno mismo o en una campana, abra la tapa. Verter el contenido del tubo en un recipiente plástico de 100 mm plato de Petri mientras balanceo suavemente el plato para conseguir una capa completa, suave y una distribución visualmente uniforme de partículas.
   PRECAUCIÓN: El calor del agar puede producir una ligera sobrepresión en el tubo. Esto a menudo produce un silbido audible y tiene el potencial para expulsar pequeñas gotitas de agar caliente.
7. Permita que las placas se enfríe a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, hasta que el agar se solidifica.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí. Tienda plateado invertida y sellados (por ejemplo, en una bolsa de plástico selladora o con la película de parafina) durante 48 horas bajo refrigeración (4 ° C).

3. adquisición de imágenes de partículas usando un estereomicroscopio y cámara digital

1. Coloque la placa destapada boca arriba sobre la platina del microscopio de un estereomicroscopio capaz de 10 x a 20 aumentos. Iluminar la muestra desde abajo con luz difusa, incluso usando equipos como un soporte del iluminador LED o luz de placa.
2. Abra el software de captura de imagen, asegúrese de la trayectoria de la luz de microscopio es fotoy haga clic en la correspondiente Cámara de la lista de la cámara.
3. Ajuste del microscopio para que múltiples partículas aparecen en el software en el plano focal con bordes grandes y bien definidos. Utilice un aumento de 10-20 x para medir partículas manteniendo un plano focal relativamente profundo.
   1. Temporalmente, quite la placa de agar y colocar el micrómetro en el escenario. Ajuste el enfoque fino hasta que las graduaciones en el micrómetro agudamente enfocadas en el software de captura de imagen.
   2. Si no previamente calibrado, grabar el pixel ratio micro para la ampliación actual.
      1. Establezca el zoom al 100% haciendo clic en Zoom > tamaño real y seleccione Opciones > calibrar luego alinee la barra de calibración rojo en la vista principal en el eje largo del micrómetro, con las barras verticales centrados en las graduaciones de 0 a 200 μm. En el cuadro de diálogo calibrar , escriba el nivel actual de la ampliación y la longitud real de 200 μm.
   3. Si ya calibrado seleccione ampliación de la barra de menú, y seleccione la ampliación actual nivel y confirma la calibración.
      1. Seleccione medidas > línea > arbitraria línea. Haga clic en la intersección de la graduación 0 y eje del micrómetro. Haga clic de nuevo en la intersección en el 200 y el largo del eje. A correcta calibración debería mostrar aproximadamente 200 μm. Elimine la línea haciendo clic sobre él, presionar delete y presionar sí en el cuadro de confirmación.
         Nota: Las instrucciones para seleccionar la cámara y la calibración son específicas para el software utilizado para este hardware. Funciones similares deben estar disponibles en otro software de proyección de imagen. El objetivo es determinar el píxel ratio micrones de la imagen para la medida de tamaño de partícula exacta.
4. Vuelva a colocar la placa de agar y ajuste el enfoque fino para lograr el máximo detalle en el software de imágenes.
5. Ajustar el software de imágenes para que se logre la máxima calidad de imagen.
   1. Aumentar la profundidad de bits para el valor máximo permitido, seleccionando el botón en el panel de la Profundidad de bits de la barra lateral de la cámara . Configure el software para la adquisición de imágenes en escala de grises seleccionando el botón de radio adecuado en el panel de Color gris de la barra lateral de la cámara .
   2. Contraer cualquier panel lateral abierto entre la exposición y el histograma. Reducir la ganancia de 1.0 y aumentar la exposición, aparezca una imagen clara en la vista y hasta que aparezca el histograma como una distribución que no se recorta por los extremos de la caja del histograma.
   3. Ajuste el histograma para evitar la sobre y subexposición. En el panel Histograma de la barra lateral de cámara, deslice el límite izquierdo del histograma a sólo fuera de los valores más bajos y el límite derecho apenas fuera de los valores más altos.
6. Guarda la imagen como un TIFF sin comprimir, incluyendo información de ampliación en los metadatos de imagen, usando el archivo > Guardar como cuadro de diálogo, seleccionar el formato TIFF y asegurándose de que la casilla Guardar información de calibración se comprueba.
   Nota: Guardar metadatos de imagen, incluyendo la calibración espacial, puede variar entre programas de adquisición. FIJI¹⁵, el software subyacente utilizado por la tubería comprende variantes más frecuentes. La información importante a registrar es el pixel altura, ancho y unidad asociada.
7. Use ya sea una etapa móvil o mover manualmente la placa en sí, seleccionar otra área, que no se superpone imágenes anteriores, siguiendo un camino que alterna entre de izquierda a derecha y de derecha a izquierda como uno se mueve hacia abajo de la placa; también conocido como un 'máquina patrón de búsqueda'. Repita el paso 3.6 hasta que se producen suficientes imágenes para capturar partículas visualmente estimadas por lo menos 500 más son mejores.
   Nota: Patrones alternativas (por ejemplo., circular, al azar) son aceptables pero deben ser informados. Adquirir múltiples imágenes superpuestas para la combinación en un mosaico via digital costura produce un tamaño de archivo resultante que dificulta mucho procesamiento descendente y artefactos de costura puede introducirse y no es recomendable.
8. Retener las placas hasta después del análisis de imagen para la proyección de imagen de seguimiento posibles. Después de la proyección de imagen final, descartar como apropiado para residuos biológicos.

4. medir y analizar las siluetas de la partícula

1. Instalar los paquetes de software de análisis de imagen requerida
   1. Instalar FIJI (una versión mejorada de ImageJ v1.52e de los institutos nacionales de salud siguiendo las instrucciones en: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Instalar git, si no está ya presente, siguiendo las instrucciones en: https://git-scm.com/downloads
   3. Adquirir el código de análisis de partículas de clonar el repositorio git del¹⁶.
      1. En la línea de comandos, recuperar la última versión del código escribiendo:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Instalar el siguiente código de análisis las instrucciones en el archivo de texto README.md se encuentran en el directorio superior del repositorio clonado.
            Nota: Usando git es preferido, como va recuperar automáticamente la última versión del código. Si git no está disponible, también es posible descargar el código en un archivo zip en la página de lanzamiento en: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Editar un archivo de texto, listado de los directorios a procesar, junto con parámetros opcionales. Consulte en el subdirectorio de ejemplos y análisis para obtener una lista de parámetros y ejemplos.
2. Ejecutar el análisis en la línea de comandos escribiendo:
   \ImageJ-win64.exe < ruta de FIJI >--consola - macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   donde < ruta de FIJI > es el directorio donde se encuentra win64.exe ImageJ y < paramsfile > la ubicación del archivo de texto que describe la configuración de análisis
   Nota: El nombre del ejecutable puede diferir dependiendo de que sistema operativo FIJI está instalado en. Dependiendo del número y tamaño de las imágenes, el análisis puede llevar unos minutos a horas y se ejecutará automáticamente.
3. Realizar control de calidad
   1. Examinar los archivos de control de calidad ubicados en el subdirectorio de superposición del directorio de resultados especificado. Nota imágenes falsas, perdidas y mal capturado partículas todo aparente como contornos de sombreado que no coinciden con el fondo. Consulte figura 3 ejemplos de ello. Los datos de la partícula ahora están listos para la generación de la figura de análisis específicos del experimento.
4. Rechazar todo placas o partículas individuales especificando en el código de análisis de los archivos conocidos y/o partículas ID a ser ignorado. Consulte los ejemplos/censura en el repositorio de código relevante R y Python.
5. Generar figuras específicas del experimento utilizando los resultados de análisis de imagen para cada imagen se almacenan en un archivo de texto separado por comas ordenado¹² en el subdirectorio resultados del directorio de resultados especificado. Consulte los ejemplos/figuras/R y ejemplos/figuras/Python subdirectorios para ejemplos de cómo leer los archivos de resultados.

Resultados

Archivos generados
El proceso ilustrado en la figura 1 produce dos archivos por imagen analizada. El primer archivo es una coma separa el archivo de texto de valores (CSV) donde cada fila corresponde a una partícula individual y las columnas describen varios indicadores de partículas tales como área, circularidad y solidez y definidos en el manual de ImageJ¹⁷. Archivos CSV de ejemplo se incluyen como información com...

Discusión

Aunque el sistema de análisis de imagen es bastante robusto y pasos de control de calidad se toman para asegurar imágenes pobres se retiran, la atención adecuada a problemas específicos en la adquisición de la imagen, muestreo y preparación de las placas puede mejorar tanto la precisión de los datos y la proporción de imágenes pasando del control de calidad.

Concentración de muestras
Suponiendo que se ha tomado una muestra representativa, es el paso más importante asegurar ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de lejía al 10%	Chlorox	31009	Para la desinfección del espacio de trabajo.
Tubo de centrífuga de 15 mL con tapón	Corning	430790	Por muestra.
Matraz Erlenmeyer de 50 mL	Corning	4980-50	Otros recipientes son adecuados siempre que puedan contener > 40 mL de muestra y permitan mezclar
500 mL Botella Kimax	Kimble-Chase	14395-50	O de lo contrario suficiente para la manipulación de agar
Agar	BD	214010	Sólido, para preparar gel al 7,5%. 7 mL por muestra.
Se sugiere software de análisis de datos	N/A	N/A	R o Python
Agua desionizada	N/A	N/A	Suficiente para preparar tinte y agar. Si no está disponible, el toque debería estar bien.
Ordenador de sobremesa	N/A	N/A	El análisis de imágenes no requiere un uso intensivo de la CPU, cualquier ordenador de sobremesa "normal" de 2017 debería ser suficiente.
Disco duro externo	Seagate	STEB5000100	No es completamente necesario, pero es extremadamente útil dada la cantidad y el tamaño de las imágenes. Se sugieren 2 o más TB de almacenamiento.
versión 1.51d	FIJI	NIH	es el núcleo de ImageJ. Los plugins se actualizan en el momento de escribir este artículo. Disponible en: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	versión 2.19.1 o posterior	Disponible en: https://git-scm.com/
Software de captura de imágenes	ToupView	versión 3.7.5177	Cualquier compatible con la cámara, puede venir con la cámara. Debería permitir guardar imágenes TIFF con datos de calibración espacial.
Etapa mecánica (X/Y) OMAX		A512	No es totalmente necesario, pero ayuda en gran medida a la adquisición de imágenes.
Azul de metileno	Fisher	M291-100	Solid, para preparar una solución al 1% p/v. 5 uL de solución por muestra.
Cámara microscópica	OMAX	A35140U	Cualquier cámara digital compatible con microscopio. Se sugiere una resolución que proporcione al menos 5 mmm por píxel con un aumento de 10x y un rango dinámico de al menos 8 bits por píxel por canal de color.
Micrómetro de etapa óptica	OMAX A36CALM1		O de otro modo suficiente para la calibración espacial.
Placa de Petri, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 por muestra.
PPE	N/A	N/A	Bata de laboratorio, guantes y gafas estándar.
Sparmoria macro	NCSU	versión 0.2.1	Disponible en el repositorio de github : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Microscopio estereoscópico/de disección	Nikon	SMZ-2T	Debe proporcionar un aumento de 10 a 20x y permitir fotos digitales con una cámara incorporada o perfilar un punto de montaje para un CCD.