Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.
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Artículo de método
Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo
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Resumen
Resumen
La capacidad de aislar los tejidos embrionarios fue un paso esencial para establecer el sistema de pollo de codorniz quimera, que a su vez ha proporcionado contribuciones indiscutibles a develar procesos clave en la biología del desarrollo.
Es en este documento se describe un método optimizado para aislar los tejidos embrionarios de codornices y pollos por microcirugía y digestión enzimática conservando sus propiedades biológicas. Después de aislamiento, los tejidos de ambas especies se asocian en un ensayo in vitro organotypic de 48 h. de codorniz y los tejidos de pollo pueden ser discriminados por las características nucleares distintas y marcadores moleculares, lo que permite el estudio de la diafonía celular entre heteroespecíficas Asociación de tejidos. Este enfoque es, por lo tanto, una herramienta útil para el estudio de las interacciones de tejido complejo en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas, tales como ésos que ocurren durante la morfogénesis faríngea y la formación del foregut órganos derivados del endodermo. Este enfoque experimental primero fue desarrollado para estudiar las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación del timo. En este sentido, el rudimento tímico potencial derivados del endodermo y mesodermo derivado mesenchyme, fueron aislados de embriones de codorniz y de pollo, respectivamente.
La capacidad de los tejidos asociados para generar órganos puede probarse más por injerto sobre la membranas corioalantoideas (CAM) de un embrión de pollo. El CAM proporciona nutrientes y permite intercambios de gases a los tejidos explanted. Después de 10 días de desarrollo de ovo, los órganos quiméricos pueden ser analizados en los explantes cosechados por los métodos morfológicos convencionales. Este procedimiento también permite estudiar las contribuciones específicas de tejido durante la formación de órganos, desde su desarrollo inicial (desarrollo in vitro) la fase final de la organogénesis (en desarrollo de ovo).
Por último, el método de aislamiento mejorado también proporciona tridimensionalmente (3D) conserva los tejidos embrionarios, que también pueden utilizarse para el análisis topográfico de alta resolución de los patrones de expresión génica específica de tejido.
Introducción
En la década de 1970, un sistema elegante de codorniz-gallina de quimera fue desarrollado por Le Douarin, abriendo nuevas vías para entender el papel de la migración celular y las interacciones celulares durante el desarrollo1,2. El modelo fue ideado en la premisa de que del intercambio entre las dos especies no molestaría considerablemente embriogénesis, confirmado más adelante cuando se utiliza para el estudio de numerosos procesos de desarrollo, incluyendo la formación de nervioso y las hematopoyéticas sistemas1. Tomando este último como un ejemplo, las ondas cíclicas de progenitores....
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Protocolo
Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de huevo de codorniz y pollo de fertilizan
- Lugar fertilizado huevos de codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) en una incubadora humidificada de 38 ° C durante 3 días. Incubar los huevos (extremo romo del huevo) hacia arriba en la cámara de aire.
Nota: El ambiente humidificado se logra colocando un recipiente de agua en la parte inferior de la incubadora. - Incubar huevos fertilizados del pollo (Gallus gallus) 2,5 días en una incubadora humidificada de 38 ....
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Resultados
El protocolo detalla un método para aislar los tejidos embrionarios aviares a utilizarse en varios métodos técnicas de biología celular y del desarrollo. Este método fue empleado anteriormente para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. Aquí, nuevos resultados se muestran en la figura 1 y figura 2, usando métodos similares.
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Discusión
El procedimiento de aislamiento de tejido embrionario detallado aquí fue mejorado de las técnicas anteriores para producir embriones quiméricos pollo codorniz en contextos biológicos3,5,6.
Este enfoque es adecuado para aislar los tejidos embrionarios puros sin necesidad de manipulación genética o el uso de marcadores específicos de tejido, que son a menudo indeterminado, limitar el uso de modelos anim.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecemos a Isabel Alcobia por la lectura crítica del manuscrito, Mário Henriques video narración y Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con un sistema de vídeo y Interaves - Sociedade Agro-pecuaria....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos fertilizados de gallina (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Granja avícola | |
| Huevos fecundados de codorniz (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Granja de aves | |
| Tubos de centrífuga PP de 15 mL Tubos de centrífuga | Corning | 430052 | |
| PP de 50 mL | Corning | 430290 | |
| Platos de Pyrex de 60 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 41 | |
| Platos de Pyrex de 100 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 48 | |
| Rejilla metálica | Rejilla de acero inoxidable Goodfellows | malla fina | |
| Filtro de membrana | Millipore | DTTP01300 | 0,6 mm Filtro de membrana Isopore |
| Placa de Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm cuencos de pyrex (tamaño pequeño) | de supermercado | ||
| Cuencos de pyrex de 100 x 50 mm (tamaño grande) | del supermercado | ||
| Pipetas de transferencia | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | Pipeta de plástico de 2 mL |
| Pipeta de vidrio Pasteur | Normax | 5426015 | |
| Cinta | de supermercado | ||
| Citoqueratina (pan; ácida y básica, citoqueratinas tipo I y II), clon Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Suero fetal bovino | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatina | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare una solución de 25 mg/mL de acuerdo con las instrucciones del fabricante; centrifugar y filtrar antes de la alícuota y almacenar a -20 °C. Las alícuotas se pueden mantener congeladas durante varios años. |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN | anticuerpo Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Kit de elastómero de silicona 1,1 kg | ELKEM/Silmid | RH141001KG | Para preparar la base trasera de la placa de Petri |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11251-30 | Pinzas finas |
| Tijeras Bonn extrafinas, curvadas | Fine Science Tools | 14085-08 | Tijeras curvas Alfileres para |
| insectos | Fine Science Tools | 26001-30 | 0,3 mm Pasador de acero inoxidable |
| Micro espátula | Fine Science Tools | 10087-12 | Cuchara de trasplante |
| Pinutien Minutien | Fine Science Tools | 26002-20 | 0,2 mm Microbisturí de acero inoxidable |
| Pines Minutien Fine | Science Tools | 26002-10 | 0,1 mm Microbisturí de acero inoxidable |
| Moria Soporte de pasadores niquelado Fine | Science Tools | 26016-12 | Soporte de alfileres niquelado |
| Moria Cuchara perforada | Herramientas de ciencia fina | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker tijera de ojo | Herramientas de ciencia fina | 15010-11 | |
| Cámara | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Leica Microsystems | DM2500 | ||
| NanoZoomer S360 Digital escáner de diapositivas | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Estereoscopio | Leica Microsystems | Leica M80 |
Referencias
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....
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