Un ensayo de comunicación Unión intercelular yoduro amarillo fluorescente proteína-Gap

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de comunicación intercelular cruce nuevo espacio diseñado para el cribado de alto rendimiento de productos químicos modulación de ensambladura de gap para el descubrimiento de medicamentos y evaluación toxicológica.

Resumen

Uniones comunicantes (GJs) son canales de la membrana de la célula que permiten difusión de moléculas más pequeñas que 1 kDa entre células adyacentes. Ya que tienen funciones fisiológicas y patológicas, hay necesidad de high-throughput screening (HTS) ensayos para identificar moduladores GJ en ensayos de toxicología y descubrimiento de drogas. Un ensayo de novela yoduro amarillo fluorescente proteína-gap comunicación Unión intercelular (I-YFP-GJIC) satisface esta necesidad. Es un ensayo basado en células como aceptor y donante de las células que están diseñadas para expresar estable una variante de la proteína amarilla fluorescente (YFP), cuya fluorescencia sensible se apaga por yoduro o SLC26A4, un transportador de yoduro, respectivamente. Cuando el yodo se añade a un cultivo mixto de los dos tipos celulares, entran en las células donantes vía el transportador SLC26A4 y difusa a las células adyacentes aceptador via GJs donde apaga la fluorescencia de YFP. Fluorescencia de YFP se mide bien por bien en un modo cinético. La tasa de amortiguamiento YFP refleja actividad GJ. El ensayo es fiable y rápida para HTS Se describe el protocolo para el ensayo de YFP-GJIC utilizando las células LN215, las células de glioma humano.

Introducción

Uniones comunicantes (GJs) actúan como Canales intercelulares que permiten la difusión de moléculas pequeñas de < 1 kDa como nutrientes, metabolitos y moléculas de señalización entre células adyacentes. Los elementos de Unión incluyen un hemichannel o connexon en cada célula, y cada connexon constituye seis conexinas (Cxs)¹. GJs y Cxs se han utilizado en los ensayos de Toxicología de carcinógenos como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), que son inhibidores GJ^2,3,4. GJIC interrumpida se ha asociado con nongenotoxic carcinogénesis

Protocolo

1. generación de lentiviruses expresando YFP^QL y SLC26A4

1. Crecer las células de riñón embrionario humano HEK293T 80% confluency en las placas de cultivo de 100 mm. Modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina μg/mL 100 es el medio de cultivo utilizado en el protocolo de mantener HEK293T y otras células que se mencionan a continuación.
2. Capa bien 6 placas por cada bien durante 10 minutos, añadir 2 mL de 0.005% de solución estéril de (PLL) de poli-l-lisina aspiración la solución PLL y enjuague la superficie dos veces con 2 mL de agua estéril.
3. Células de ....

Resultados

29 placas 96 pocillos fueron utilizadas para detectar productos 2.320 químicos para identificar moduladores GJIC novela por ensayo GJIC-YFP usando el LN215-YFP^QL y LN215-I⁻ células. Los resultados obtenidos con una placa representativa se muestran en la figura 2. El porcentaje de fluorescencia de YFP en cada pozo se muestra como un gráfico de líneas en la figura 2A y el porcentaje de activid.......

Discusión

El ensayo de YFP-GJIC puede utilizarse para HTS porque es robusto, rápido y barato. Un ensayo HTS es considerado robusto si el Z'-factor está por encima de 0,5²⁵. Ver Zhang et al. para una descripción del análisis estadístico utilizado para evaluar la idoneidad de HTS ensayos²⁵. Cuando se utilizaron las células de LN215, el Z'-factor fue > 0,5 sin ninguna optimización de ensayo. Si se utilizan otros tipos de células en el ensayo y su Z'-factor es < 0.5, la robustez puede me.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 96 pocillos	SPL	30096
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma	C5670	I-solución
D-(+)-glucosa	Sigma	G7021	C-solución, I-solución
Dimetilsulfóxido (DMSO)	sigma	276855
HEPES	Sigma	RES6003H-B7	C-solución, I-solución
Lipofectamine 2000	transfección	Invitrogen	11668-027
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 6H2O)	Sigma	M2393	C-solution
Lector de microplacas	BMG LabTech	POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G	Addgene	#12259
Polybrene	sigma	H9268
Solución de poli-L-lisina	sigma	P4707
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma	P5405	C-solución, I-solución
psPAX2	Addgene	#12260
Dihidrocloruro de puromicina	sigma	P8833
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S5886	C-solución, I-solución
Hiróxido de sodio (NaOH)	Sigma	S2770
Yoduro de sodio (NaI)	Sigma	383112	I-solution