Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.
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Artículo de método
Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos
En este artículo
Resumen
Resumen
La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.
Introducción
La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar l....
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Protocolo
1. general mantenimiento de cepas de GC
- Raya de cepas de N. gonorrhoeae en el agar de GCK con 1% Kellogg suplementos18 (tabla 1, tabla 2) de las existencias de congelador e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h. uso MS11 expresando fase variable Opa (MS11Opa +), no hay Opa (MS11ΔOpa), o a LOS truncada (MS11ΔLgtE).
- Cuidadosamente escoge pili negativo (Colonia sin borde oscuro) o positivo (Colonia con borde oscuro) colonias de cada cepa basada en morfología de Colonia19 mediante una disección microscopio y raya en una nueva placa de GCK.
- Incubar a 37 ° C....
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Resultados
Dos métodos fueron empleados: un análisis de utilización de ATP y una prueba de tinción vivo/muerto. Los resultados pueden combinar o utilizar individualmente para estudiaron la supervivencia bacteriana en agregados después del tratamiento antibiótico. Ha demostrado el análisis de utilización de ATP para medir exactamente viables bacterias en biofilms de S. aureus 20,21. Aquí, MS11Opa + Pil + cepa fue utilizado para exami.......
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Discusión
Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC obtenid.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de salud para D.C.S. y W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., y E.N. fueron apoyadas en parte o participar en el programa "La experiencia y de investigación primer año innovación" financiado por la Universidad de Maryland. Los fundadores no tenían ningún papel en el estudio de diseño, recopilación de datos y análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Reconocemos el UMD CBMG Imaging Core para todos los experimentos de microscopía.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100x Suplemento | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC base media | BD | 228950 | |
| Nitrato férrico, nonahidratado | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucosa | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamina Polvo cristalino | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight tinción viva/muerta | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae cepa | amablemente proporcionada por el Dr. Herman Schneider, Walter Reed Instituto del Ejército para Investigación | ||
| Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptona | BD Biosciences | 211693 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Almidón soluble | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Pirofosfato de tiamina | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipo | |||
| Placas de Petri | VWR | 25384-302 | |
| 8 pocillos cámara de fondo deslizante | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Corning, Gabinete | 3370 | |
| (NU-425-600 Clase II, A2 Campana de riesgo biológico de flujo laminar) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubadora | Fisher Scientific | ||
| equipado con cámara de imagen en vivo | Leica | SP5X | |
| Corning Microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos | Iluminador Corning | 3904 | |
| Glomax | Promega | E6521 | |
| Puntas de pipeta (0.1-10 y micro; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Puntas de pipeta (1000 y micro; L) | VWR | 83007-382 | |
| Puntas de pipeta (200 y micro; L) | VWR | 53509-007 | |
| Espectrofotómetro Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Tubos cónicos estériles de 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Tubos de microcentrífuga estériles (1,7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Aplicadores estériles con punta de poliéster | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent a 9110001 |
Referencias
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
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Reimpresiones y permisos
