La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.
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Artículo de método
Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic
En este artículo
Resumen
Resumen
La hormona que segrega la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. El método descrito aquí es el procedimiento de células suprarrenales primarios de rata cultivadas y ensayos funcionales relacionados (tinción de inmunofluorescencia de proteína superficial de la gota de lípidos, así como análisis de corticosterona). A diferencia de un modelo in vivo, la variación del interexperiments en cultivos monocapa suprarrenal es inferior y la condición experimental es fácil de controlar. Además, la fuente de las ratas también es más estable que otros animales, como bovinos. También hay varias líneas de células suprarrenales humanas (NCI-aviones usados H295 NCI-H295R, SW13, etc.) que pueden utilizarse en estudios suprarrenales. Sin embargo, la producción de esteroides de estas líneas todavía se verá afectada por numerosos factores, que incluyen el número de lote de suero, pasaje número, mutante, pérdida de genes distintos, etcetera. Excepción de falta de 17α-hidroxilasa, el cultivo primario de células adrenocorticales de rata es una técnica mejor y más conveniente para el estudio de fisiología suprarrenal. En Resumen, culturas suprarrenal de la rata principal podrían ser una buena plataforma in vitro por investigadores investigar los mecanismos del reactivo de interés en el sistema de la glándula suprarrenal.
Introducción
El sistema endocrino es responsable de la regulación de actividades fisiológicas y homeostasis1. Glándulas suprarrenales, situadas en el polo craneal de los riñones son uno de los principales órganos endocrinos que secretan mineralocorticoides, glucocorticoides y andrógenos2,3. Hay dos partes distintas de la glándula suprarrenal: la corteza y la médula. La corteza suprarrenal se compone de tres capas: la glomerulosa externa, fasciculada intermedia y los reticularis interno3. La zona glomerular es el sitio original de la secreción de la aldosterona, un mineralocor....
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Protocolo
Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por institucional Animal cuidado y uso Comité de Kaohsiung Medical University.
1. experimental procedimiento
- Sacrificio de las ratas de SD hembra/macho adulto (8 a 12 semanas de edad) por eutanasia de CO2 .
- Aplicar etanol al 70% y dejar ser absorbidos por la piel y luego limpie la piel con un papel de tejido.
- Colocar la rata en una placa de plástico en la posición supina.
- Levante la piel con unas pinzas curvas "externas" en la línea media y realizar una disección Roma mediante la creación de una forma de "Y....
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Resultados
Utilizando el procedimiento descrito aquí, las células suprarrenales cultivadas primarias podían distinguirse bajo el microscopio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar aún más que las vesículas dentro del citoplasma son gotitas del lípido, la tinción de inmunofluorescencia de proteína relacionada con la diferenciación adiposa (ADRP) podría llevarse a cabo en día 3 culturas (figura 1B). Las células fueron cultivadas en .......
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Discusión
Las glándulas suprarrenales desempeñan un papel clave en la adaptación al medio3. La hormona que segrega la corteza suprarrenal puede regular y ajustar las funciones fisiológicas y homeostasis3. El modelo in vivo refleja los efectos fisiológicos reales en el cuerpo. Sin embargo, todavía está influenciada por muchos factores complejos, causando efectos inestables en experimentos. En contraste, el modelo de célula en vitro tiene ventajas que lo hace incomparable para el model.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Taiwán de Consejo Nacional de ciencia (NSC102-2320-B-037-008-MY3) y una nacional Cheng Kung University Hospital beca de investigación (NCKUH-10102045).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratas hembra/macho, SD/Wistar (8-12 semanas)Las | de BioLASCO | son adecuadas para los experimentos. Las glándulas suprarrenales de las hembras son más grandes que las ratas macho, sin embargo, las ratas hembras poseen los ciclos estrales que pueden influir en los experimentos | |
| Colagenasa, tipo II | Sigma | C-6885 | aislamiento de células suprarrenales |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | medios en polvo para células suprarrenales |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | medios en polvo para células suprarrenales |
| HEPES | TJ.baker | 4018 | tampón (polvo) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Suero de caballo | Hyclone | 16050014 | |
| Suero fetal bovino | SAFC | 12103C | |
| Penicilina (10.000 U)-estreptomicina (10.000 ug/mL) | Antibióticos Corning | 30-002-Cl | |
| Pinzas curvas | BRAUN | BD343R | |
| Pinza | BRAUN | BD331R | |
| Tijera | BRAUN | BC224R | corte piel y músculo de rata |
| Tijera delicada | BRAUN | BC101R | corte glándulas suprarrenales |
| Proteína relacionada con la diferenciación adiposa | Abcam | ab108323 | Anticuerpo para la proteína asociada a gotas de lípidos |
| Kit ELISA de corticosterona | caimán | 500655 | ensayo para la síntesis de corticosterona |
| Microscopía de luz invertida Microscopio | Leica | ||
| Nikon | |||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | para tinción por inmunofluorescencia |
| IgG anti-conejo de cabra Alexa 488 Anticuerpo secundario de flúor | ThermoFisher | A-11034 | para tinción |
| por inmunofluorescenciaAnti-ADFP | Abcam | 108323 | para la tinción de inmunofluorescencia |
| ProLong Gold Mountant antidecoloración | ThermoFisher | P36935 | para la tinción por inmunofluorescencia |
Referencias
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Tre....
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Reimpresiones y permisos
