Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.
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Artículo de método
Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica
En este artículo
Resumen
Resumen
Esferoides tumorales se han desarrollado como un modelo de cultura (3D) tridimensional de la célula de cáncer investigación y lucha contra el cáncer el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, actualmente, las modalidades de la proyección de imagen de alto rendimiento utilizando detección de campo o fluorescencia brillante, son incapaces de resolver la estructura total 3D de la esferoide de tumor debido a la limitada penetración de la luz, difusión de tintes fluorescentes y profundidad-resolución. Recientemente, nuestro laboratorio demostró el uso de tomografía de coherencia óptica (OCT), no destructiva y sin etiqueta 3D de modalidad, para realizar la caracterización longitudinal de esferoides multicelulares tumor en una placa de 96 pocillos. OCT es capaz de obtener información morfológica y fisiológica 3D de esferoides de tumor creciendo hasta llegar a alrededor de 600 μm de altura. En este artículo, se demuestra un sistema de proyección de imagen de OCT (HT-OCT) alto rendimiento que escanea la placa entera y bien y obtiene datos de OCT 3D de esferoides tumorales automáticamente. Se describen los detalles de las pautas de construcción y sistema de HT-OCT en el protocolo. De los datos de OCT 3D, uno puede visualizar la estructura global del esferoide con 3D prestados y cortes ortogonales, caracterizar la curva de crecimiento longitudinal de la esferoide tumor basado en la información morfológica de tamaño y volumen y controlar el crecimiento de las regiones de muerte celular en el esferoide de tumor basado en contraste óptico atenuación intrínseca. Mostramos que el HT-OCT puede utilizarse como una modalidad de proyección de imagen de alto rendimiento para droga detección, así como caracterizar las muestras biofabricated.
Introducción
El cáncer es la segunda causa de muerte en el mundo1. Desarrollo de fármacos contra el cáncer es de crucial importancia para los pacientes. Sin embargo, se estima que más del 90% de los nuevos fármacos contra el cáncer no en fase de desarrollo debido a la falta de eficacia y toxicidad inesperada en ensayos clínicos2. Parte de la razón puede atribuirse a la utilización de modelos de cultura de célula (2D) de dos dimensiones simple para la detección compuesto, que proporcionan resultados limitados valores predictivos de toxicidad y eficacia compuesto por las siguientes etapas de descubrimiento de drogas2<....
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Protocolo
1. preparación de las células
- Obtener líneas de células de un proveedor calificado.
Nota: Verifique que las células de las líneas celulares de interés pueden formar esferoide en los medios de cultivo o con la ayuda de un sustrato (matriz de la membrana basal como Matrigel). Buscar en la literatura9 o realizar una ronda de un pre experimento para una revisión. - Descongelar las células congeladas siguiendo el procedimiento específico suministrado por el proveedor de la línea celular. Un procedimiento general puede encontrarse en otra parte43.
- Las células de 1-2 pasos en frascos de cultivo de....
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Resultados
Alto rendimiento proyección de imagen de tomografía de coherencia óptica de esferoides en una placa de 96 pocillos
Figura 3 muestra el resultado de HT-OCT la exploración de una placa de 96 pocillos con HCT 116 esferoides de tumor el día 3. La exploración secuencial de la placa todo comienza desde el pozo de abajo a la derecha (H12). Figura 3B muestra el diagrama de flujo d.......
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Discusión
Actividad tumoral es muy importante a su estructura morfológica. Similar a control de curva de crecimiento característica de cultivos celulares 2D, seguimiento de la curva de crecimiento de esferoides tumorales 3D es también un enfoque convencional para caracterizar el comportamiento a largo plazo de crecimiento de esferoide para diferentes líneas celulares. En particular, podemos caracterizar la respuesta de drogas mediante el análisis de degradación del tumor o recrecimiento del tumor directamente reflejada en la curva.......
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Divulgaciones
Los autores no divulgar ningún interés concurrentes.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (PII-1640707), NIH fondo de inicio de becas R21EY026380, R15EB019704 y R01EB025209 y la Universidad de Lehigh.
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Materiales
espectrómetro fuerte/fuerte > lente Adaptador Thorlabs Lente colimadora Thorlabs
Filtro de de sujeción Thorlabs Galvanómetro Thorlabs AC080-020-C de relé AC254-100-C JTH360XY Soporte de placa de rotación de etapa de rotación de etapaEscáner digital de Sistema SD-OCT de la : : de adquisición OCT de procesamiento OCT
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de imágenes OCT de dominio espectral personalizado< / fuerte> | Desarrollado en nuestro laboratorio | ||
| Diodo superluminiscente (SLD) | Thorlabs< / fuerte> | SLD1325< / fuente > | luz |
| fuerte 2 veces; 2 acopladores de fibra fundida monomodo, relación de división 50:50 | Fotónica de CA | WP13500202B201 | |
| Brazo de referenciaTubo de | |||
| lente | Thorlabs | ||
| Adaptador | Thorlabs | ||
| Lente colimadora | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Lente de enfoque | Thorlabs | ||
| Montura de espejo cinemática | Thorlabs | ||
| Espejo | Thorlabs | ||
| 1D Etapa traslacional | Thorlabs | ||
| densidad neutra continuo | Thorlabs Horquilla | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Thorlabs | |||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Adaptador Thorlabs | ||
| Lente Colimadora | Thorlabs | ||
| Lente | Thorlabs Thorlabs | ||
| dos lentes de relé para hacer una configuración de telescopio | |||
| Montura de espejo triangular | Thorlabs Espejo Thorlabs | ||
| Objetivo | Mitutoyo | ||
| Poste pedestal | Thorlabs | ||
| Horquilla de sujeción | Thorlabs Controlador de | ||
| polarización | Thorlabs Montaje en jaula de | ||
| 30 mm | Thorlabs | ||
| Jaula Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorizado etapa de traducción | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | ||
| inclinable 2D | |||
| impreso en 3D | |||
| Thorlabs | AC080-020-C | ||
| Rejilla | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| Lente F-theta | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Sensor de cámara de escaneo lineal | ilimitado | SU1024-LDH2 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Observaciones |
| >Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Línea celular | ATCC | CCL-247 | |
| Matraz de cultivo celular | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipeta | Fisherbrand | 14388100 | |
| Puntas de pipeta | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific 10569044 | ||
| Suero bovino fetal, certificado, origen estadounidense | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100X) | Thermo Fisher Scientific 15240062 | ||
| Corning Microplaca de fijación ultrabaja con fondo redondo transparente de 96 pocillos | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0,5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Incubadoras de CO2 con camisa de agua | Guantes Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| VWR | 89428-750 | ||
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Pipetas de transferencia | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5702 R | Para centrifugar la centrífuga de tubo de 15 mL |
| NUAIRE | AWEL CF 48-R | Para centrifugar la placa de 96 pocillos | |
| Microscopio | Olympus | ||
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Histología & IHC | |||
| portaobjetos | Leica | Aperio AT2 | Obtención de imágenes histológicas de alta resolución |
| Servicio de Histología | Histowiz | Solicitar servicio de tinción histológica e inmunohistológica del tumor esferoide | |
| Name | >Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Lista de OCTs comerciales | |||
| sistema SD-OCC | Thorlabs | serie | |
| Telesto | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji también funciona. |
| Renderizado 3D | Thermo Fisher Scientific | Amira | Software comercial. Opción 1 |
| Renderizado 3D | Bitplane, | Imaris: | Software comercial. Opción 2. Utilizado en el protocolo |
| de software | desarrollado a medida en C++. | ||
| Control de etapa | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporado en el código de adquisición OCT personalizado, |
| software | desarrollado a medida en C++. Utilice la GPU. Incorporado en el código de adquisición OCT personalizado. | ||
| Análisis morfológico y fisiológico | desarrollado a medida en MATLAB |
Referencias
- WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
- Breslin, S., O'Driscoll, L.
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Reimpresiones y permisos
