Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

Resumen

Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2'-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.

Resumen

En el proceso de desarrollo de fármacos de moléculas pequeñas metas de RNA, se desea dilucidar los cambios estructurales en sus interacciones con secuencias de RNA Diana. Aquí proporcionamos una detallada en vitro y en célula selectiva 2'-hidroxilo acilación analizadas por extensión primer Protocolo (forma) para estudiar el cambio estructural del RNA en presencia de una droga experimental para la atrofia muscular espinal (SMA), la supervivencia de la neurona de motor (SMN)-C2 y en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2. En la forma in vitro, una secuencia de ARN de 140 nucleótidos que contienen SMN2 exón 7 transcripción por polimerasa del RNA T7, doblada en presencia de SMN-C2 y modificada posteriormente por un reactivo de acilación suave 2'-OH, imidazolide ácido 2-methylnicotinic (NAI). Esta aducción 2'-OH-NAI más es sondeado por un ³²extensión primer marcado con P y resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Por el contrario, Acilación de la 2'-OH en la forma en las células ocurre in situ con SMN-C2 límite ARN celular en las células vivas. La secuencia de pre-mRNA del exón 7 en el gen SMN2, y mutaciones inducidas por la forma en la extensión de la cartilla, entonces fue amplificada por PCR y secuenciación de próxima generación. Comparando las dos metodologías, forma in vitro es un método más económico y no requiere de poder computacional a visualizar los resultados. Sin embargo, el modelo in vitro de RNA forma derivada a veces se desvía de la estructura secundaria en el contexto celular, probablemente debido a la pérdida de todas las interacciones con proteínas RNA-que atan. FORMA en la célula no necesita un lugar de trabajo de material radiactivo y produce una precisa estructura secundaria del RNA en el contexto celular. Además, forma en las células es generalmente aplicable para una mayor gama de RNA las secuencias (~ 1.000 nucleótidos) utilizando secuenciación de próxima generación, en comparación con el in vitro de la forma (~ 200 nucleótidos) que generalmente se basa en el análisis de la página. En el caso del exón 7 en el pre-mRNA de SMN2, derivados de la forma in vitro y en células RNA modelos son similares entre sí.

Introducción

Acilación selectiva 2'-hidroxilo por extensión de la cartilla (forma) es un método de medición de la cinética de cada nucleótido en una secuencia de ARN de interés y elucidar la estructura secundaria en el nucleótido resolución¹. Metodologías de la forma, tanto en condiciones in vitro^2,3,4 (RNA purificado en un sistema de amortiguamiento definida) y en vida de células de mamífero^5,6, se han desarrollado para investigar la secundaria estructura de secuencias de RNA de longitud media (normalmente....

Protocolo

1. in Vitro forma

Nota: El protocolo se modifica el protocolo publicado¹.

1. Preparación de la plantilla del RNA
   Nota: La plantilla para la transcripción de T7 fue ordenada como un sintético de doble cadena DNA (dsDNA) y amplificada por cada inserción en un vector de e. coli que lleva un único par de sitios de endonucleasa de restricción EcoRI/BamHI, como pET28a, o por PCR. El protocolo de amplificación por PCR se ilustra a continuación.
   1. Mezclar el material siguiente: 50 μL de la master de la polimerización en cadena de la mezcla (véase

Resultados

Previamente demostramos que un RNA splicing modulador, SMN-C2, interactúa con motivo de la AGGAAG en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2 y utilizó la forma para evaluar los cambios estructurales del RNA en presencia de SMN-C2⁶. El sitio de unión del SMN-C2 es distinto de los oligonucleótidos antisentido aprobado por la FDA (ASO) para el SMA, nusinersen, que se une y bloquea el silenciador que empalma intronic (ISS) en el intrón 7^27,

Discusión

En la forma in vitro, es fundamental utilizar plantilla de RNA homogéneo de alta calidad. Transcripción de T7, sin embargo, a menudo produce secuencias heterogéneas³⁶. Especialmente, secuencias de nucleótidos de ±1 en el 3'-terminal con rendimientos no despreciable³⁶ son generalmente difíciles de extirpar por purificación del gel de poliacrilamida. Plantilla de RNA heterogéneo puede resultar en más de un sistema de la señal en el gel de secuenciación perfiles del producto d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Oligonucleótido de ADN	IDT		gBlock para síntesis de ADN de >200 pb
Phusion Green Hot Start II Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Thermo	Fisher	F566S Kit de
limpieza de gel y PCR NucleoSpin	Takara	740609.50
MegaScript T7 Thermo	Fisher	AM1333	Contiene 10x tampón de reacción, enzima T7, NTP y Turbo DNasa
Agua tratada con DEPC	Thermo Fisher	750023
2x TBE-tampón de muestra de urea	Thermo Fisher	LC6876
40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x tampón TBE	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Unidad de filtrado	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
SYBR-Safe dye	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-urea mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
Hyperscreen™ Criba intensificadora	GE Healthcare	RPN1669	calcio Criba de fósforo de tungstato
criba de almacenamiento de fósforo	Molecular Dynamics	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI (2M)	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	Thermo Fisher	AM9515
SuperScript IV Reverso Transcriptase	Thermo Fisher	18090010	Contiene 5x tampón RT, mezcla SuperScript IV
dNTP (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP set (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
papel de filtro grande	Whatman	1001-917
Secador de gel	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	También contiene RNasa A y proteasa K
SMN2 minigene34	Addgene	72287
FBS Thermo	Fisher	10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS sin Ca/Mg	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
Mini columna RNeasy	Qiagen	74104	También contiene RW1, tampón RPE
Juego de DNasa libre de RNasa	Qiagen	79254	Contiene tampón DNasa I y RDD
Formamida	desionizadaThermo Fisher	AM9342
MnCl2• 4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
nonámero aleatorio	Sigma-Aldrich	R7647
Sistema de síntesis de primera cadena SuperScript	Thermo Fisher	11904-018	Contiene 10x tampón RT, transcriptasa inversa SuperScript II
AccuPrime PFX ADN polimerosa	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina
Columna NucAway	Thermo Fisher	AM10070	para desalinizar