Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

Acilación selectiva 2'-hidroxilo por extensión de la cartilla (forma) es un método de medición de la cinética de cada nucleótido en una secuencia de ARN de interés y elucidar la estructura secundaria en el nucleótido resolución¹. Metodologías de la forma, tanto en condiciones in vitro^2,3,4 (RNA purificado en un sistema de amortiguamiento definida) y en vida de células de mamífero^5,6, se han desarrollado para investigar la secundaria estructura de secuencias de RNA de longitud media (normalmente < 1.000 nucleótidos de forma en las células y < 200 nucleótidos de forma in vitro). Es particularmente útil para evaluar los cambios estructurales en el receptor del RNA en Unión a interacción con RNA molécula pequeña metabolitos^2,4,para^7,8 y estudiar acciones mecánicas de moléculas de RNA de metas durante el desarrollo de drogas^9,10.

Descubrimiento de fármacos dirigidos a RNA recientemente ha atraído atención en laboratorios académicos y la industria farmacéutica^11,12 a través de diferentes enfoques y estrategias^{13,14,15 ,16}. Ejemplos recientes de RNA-dirigido a pequeñas moléculas para el uso clínico incluyen dos medicamentos experimentales estructuralmente distintas, LMI-070¹⁷ y RG-7916^18,19, para la atrofia muscular espinal (SMA), que demostró prometedor resultados en la fase II ensayos clínicos²⁰. Ambas moléculas fueron demostrado a la supervivencia de la blanco de la neurona de motor (SMN) 2 pre-mRNA y regular el proceso de empalme del SMN2 gene^6,17,21. Previamente demostramos la aplicación de in vitro y forma en las células en un examen de los cambios estructurales objetivo RNA en presencia de un análogo de la RG-7916 conocido como SMN-C2⁶.

En principio, forma mide la tasa de Acilación de 2'-OH de cada nucleótido de una secuencia de ARN en presencia de cantidades excesivas de un reactivo de acilación por enfriamiento de una manera imparcial. El reactivo de acilación no es estable en agua, con una vida media corta de (p. ej., T_1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhídrido; o 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide ácido 2-methylnicotinic, NAI)²² y la insensibilidad a la identidad de las bases de²³. Esto resulta en una acilación más favorable de los grupos 2'-OH de bases flexibles, que pueden transformarse en una evaluación precisa de la dinámica de cada nucleótido. En concreto, un nucleótido en un par de base es generalmente menos reactivo que no emparejada a un reactivo modificar 2'-OH, como NAI y 1 M 7.

Mirando la fuente de la plantilla del RNA y en 2'-OH acilación ocurre, forma generalmente puede ser clasificada en forma in vitro y en células. En usos de vitro forma purificada T7 transcrito RNA y carece de un contexto celular en diseños experimentales. En forma de celdas, la transcripción del RNA plantilla y 2'-OH acilación ocurren dentro de las células vivas; por lo tanto, los resultados pueden recapitular el modelo estructural del RNA en un contexto celular. FORMA en las células se ha referido como vivo forma para la forma en las células vivas en la literatura²⁴. Ya que este experimento no se realiza en un animal, llama este experimento como forma en las células para la exactitud.

Las estrategias para la etapa de extensión de la cartilla de forma in vitro y en células también son diferentes. En la forma in vitro, reversa de la transcripción se detiene en la posición de la acilación de 2'-OH en presencia de Mg^{2 +}. Por lo tanto, una extensión de la cartilla de ³²P etiqueta aparece como una banda en electroforesis del gel de poliacrilamida (PAGE) y la intensidad de la banda es proporcional a la acilación tipo¹. En forma de celdas, la transcripción reversa genera mutaciones aleatorias en el 2'-OH aducción posición en presencia de Mn^{2 +}. La tasa mutacional de cada nucleótido puede ser capturada por en secuenciación de próxima generación de profundidad, y luego se puede calcular la reactividad de la forma en la resolución del solo-nucleótido.

Un problema potencial para la forma en las células es la baja relación de señal a ruido (es decir, la mayoría de los grupos 2'-OH es sin modificar, mientras que las secuencias no modificadas ocupan la mayor parte de la lectura en secuenciación de próxima generación). Recientemente, un método para enriquecer el 2'-OH modificado RNA, que se refiere como en vivo haga clic en forma (icSHAPE), fue desarrollado por el laboratorio de Chang²⁵. Este método de enriquecimiento puede ser ventajoso en el estudio de débiles pequeñas moléculas como interacciones RNA, especialmente en un interrogatorio de todo el transcriptoma.

1. in Vitro forma

Nota: El protocolo se modifica el protocolo publicado¹.

1. Preparación de la plantilla del RNA
   Nota: La plantilla para la transcripción de T7 fue ordenada como un sintético de doble cadena DNA (dsDNA) y amplificada por cada inserción en un vector de e. coli que lleva un único par de sitios de endonucleasa de restricción EcoRI/BamHI, como pET28a, o por PCR. El protocolo de amplificación por PCR se ilustra a continuación.
   1. Mezclar el material siguiente: 50 μL de la master de la polimerización en cadena de la mezcla (véase Tabla de materiales), 2 μL de cada cebador en 10 μM (ver tabla 1 para las secuencias), 200 ng de dsDNA plantilla de 2 μL y 3 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y 41 μL de H₂O. alícuota en dos PCR tubos (cada tubo contiene 50 μL de mezcla de reacción).
   2. Configurar el termociclador como sigue: etapa 1) 95 ° C por 30 s; etapa 2) 95 ° C por 20 s; etapa 3) 56 ° C durante 20 s; etapa 4) 72 ° C por 20 s; lazo de la etapa 5) hacia la etapa 2 durante 30 ciclos; etapa 6) 72 ° C por 3 min; y fase 7) infinito sostiene a 4 ° C hasta que el siguiente paso.
   3. Purificar el amplicon PCR por la extracción de láminas de gel (véase Tabla de materiales y uso el protocolo del fabricante). Eluir el producto ADN con 35 μL de tampón Tris-EDTA (TE), que contiene 10 mM Tris (pH 8.0) y 1 mM EDTA, para rendir un 0,1 – 0,5 μg/μL plantilla. Normalizar la plantilla de la DNA purificada en 0.10 μg/μL.
      Nota: Opcionalmente, puede analizarse la calidad de la plantilla en una electroforesis de gel de agarosa al 1,8% con 0.10 μg de DNA. Se espera una única banda de ADN de la plantilla deseada en el gel.
   4. Configurar la reacción de transcripción T7 (volumen total 40 μL) mediante la adición de los siguientes materiales en un tubo PCR: 4 μL de 10 x buffer de reacción, 4 μL de ATP, 4 μL de CTP, 4 μL de GTP, 4 μL de UTP, 4 μL de enzima de T7 (véase Tabla de materiales) , 4 μL de amplicones PCR purificado de paso 1.1.3 (0,4 μg) y 12 μL de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 4 x. Incubar a 37 ° C durante 4 a 16 h en un termociclador o en una incubadora de 37 ° C.
      Nota: Empezar a configurar paso 1.1.6 mientras la reacción en el paso 1.1.4.
   5. Añadir 2 μL de DNasa, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 4 x e incubar a 37 ° C por 15 minutos de mezcla con igual volumen de 2 x Tris-borato-EDTA (TBE)-tampón de urea (véase Tabla de materiales). Calentar a 70 ° C por 3 min inactivar.
   6. En una botella libre de Rnasa, mezclar 75 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida de 40% (29: 1, véase Tabla de materiales), 180,2 g de urea y 50 mL de tampón de x TBE 10 (libre de Rnasa, véase Tabla de materiales). Puso la botella en un agitador orbital (250 rpm) hasta que se disuelvan todos los cristales de urea (puede tardar hasta 2 horas). Ajustar el volumen a 500 mL con agua tratada con DEPC. Filtrar la solución con una membrana de 0.2 μm (véase Tabla de materiales).
      Nota: En este proceso, evitar uso de especular y barra de agitación para evitar la contaminación de la Rnasa. La solución puede conservarse a 4 ° C hasta 1 año.
   7. Limpiar dos placas de vidrio de electroforesis de un tamaño apropiado (16,5 x 24 cm) con agua desionizada y el 70% EtOH mediante un trozo de papel de limpieza. Alinee las placas con un par de espaciadores de 2,0 mm (placa con superficie siliconada es mirando hacia el interior) y sellar el borde de las placas con cinta adhesiva. Cinta doble la esquina de la placa para evitar fugas.
   8. En un vaso de precipitados, mezclar 200 mL de solución de acrilamida de paso 1.1.6, 2,0 mL de solución de persulfato de amonio 10% y 100 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED) con una punta de pipeta libre de Rnasa removiendo rápidamente durante 30 s. inclinación las placas en un pedazo de cubierta de la mesa y verter la solución de la brecha de las placas. Toque en la placa para levantar cualquier burbujas y colocar la placa sobre la cubierta de la mesa. Inmediatamente insertar el peine y deje que el gel polimerice durante al menos 1 h.
      Nota: Si el gel debe ser utilizado dentro del siguiente día, tapar la parte superior del gel con un pedazo de toalla de papel húmeda y envolver con un trozo más grande de la envoltura de plástico. Colocarla plana a 4 ° C.
   9. Retire la cinta y la placa de la abrazadera en un soporte de la electroforesis. Retire el peine y añadir suficiente 1 buffer de x TBE en la parte superior e inferior del depósito. Funcionamiento previo el gel por 30 min a 20 w.
      Nota: Opcionalmente, si el contenido de ARN deseado es ~ 90% o más, un mini-gel puede utilizarse en sustitución de un gel preparativo.
   10. Lave cada uno de los pozos de carga mediante pipeteo arriba y abajo dos veces con el líquido en el depósito. Añadir RNA crudo de paso 1.1.5 en los pocillos. Correr el gel a 20 W hasta el tinte de cyanol FF de xileno (azul claro) pasa cerca de dos tercios de la longitud del gel (~ 60 min).
       Nota: Asegúrese de no más de un tercio de la altura del pozo de la carga (use pozos múltiples si es necesario).
   11. Sumergir el gel en 1 x TBE solución tampón con dilución 1: 10,000 de la caja de seguridad (véase Tabla de materiales) del tinte en un recipiente suficientemente grande para que el gel. Coloque el recipiente en un agitador orbital durante 5 minutos a 80 rpm.
   12. Bajo luz UV, identificar la banda de RNA deseada y cortar rápidamente una venda fina del gel utilizando una cuchilla de limpieza. Colocar rodajas de gel 1-2 en un tubo de 1,7 mL.
   13. Recuperar el RNA de la rebanada de gel por elución pasiva. Añada la mezcla de elución/precipitación adecuada (~0.3 mL por rebanada) a cada tubo: 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS) en agua tratada con DEPC. Gire el tubo que contiene el gel empalmes a 4 ° C por 16 h.
       Nota: Una tasa de recuperación típico es ~ 75% en este paso. Para aumentar el rendimiento, quitar y recoger el eluyente y agregar el mismo volumen de tampón de elución, después Repita este paso.
   14. Combinar el eluyente en un nuevo tubo de 1,7 mL. Agregar 2,5 x EtOH helada, invertir los tubos seis veces para mezclar el líquido y colocar los tubos a-80 ° C durante al menos 1 h.
   15. Centrifugar 10 min a 10.000 x g a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo. Lavar el pellet de RNA mediante la adición de 80% EtOH (1 mL por tubo), vortex por 15 s y centrifugar 10 min a 10.000 x g a 4 ° C.
   16. Quite el sobrenadante y secar el pellet de RNA para 5 minutos añadir 50 μL de agua libre de ARNasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Normalizar la concentración de RNA a 0.10 μg/μL. Tienda el RNA purificado a-80 ° C.
       Nota: No secar demasiado el pellet de RNA.
   17. Opcionalmente, para analizar la calidad del ARN, diluir 1 μL (100 ng) de ARN de paso 1.1.16 en 5 μL de agua y mezclar con 5 μL de 2 x TBE urea sample buffer. Luego, calor a 70 ° C por 3 min y carga en un mini-gel TBE urea al 6%.
       1. Ejecute el gel a 180 V por 1 h. realizar la tinción como hecho en el paso 1.1.11. Visualizar el gel UV en un sistema de proyección de imagen. Se espera una única banda en la longitud deseada.
2. Preparación de ³²primer marcado con P
   1. Establecer la reacción mezclando los siguientes materiales: 10 μL de γ -³²P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, véase Tabla de materiales), 2 μL de cebador de transcripción inversa (RT) (100 μM, para ver secuencia de la tabla 1), 2 μL de 10 x T4 quinasa de Polinucleótido (PNK) tampón de reacción, 1 μL de T4 PNK (véase Tabla de materiales) y 5 μL de agua libre de ARNasa. Incubar a 37 ° C durante 1 h.
      PRECAUCIÓN: Protección adecuada es necesario pasos 1.2-1.5 en un lugar autorizado para materiales radiactivos.
   2. Inactive por calor por 20 min a 65 ° C. Añadir las muestras en una columna de desalación y centrifugar a 1.000 x g para 1 minuto de la mezcla eluyente con 25 μL de tampón TBE urea de 2 x. .
      Nota: Almacenar el producto crudo etiquetado a-20 ° C si no es purificada inmediatamente.
   3. Correr un gel de acrilamida de 10% a 20 W durante 1 hora.
      PRECAUCIÓN: Carga ³²primer marcado con P de paso 1.2.1 sobre el gel y evitar el sangrado de la radiactividad en el depósito superior. No cargue más de un tercio de la altura del pozo para asegurar una fina banda en el gel (utilizar pocillos múltiples si es necesario). El líquido en el depósito inferior puede ser altamente radiactivo.
   4. Retire las placas de vidrio de la cinta de gel y colocar el gel en un pedazo de plástico. Doble la envoltura plástica para cubrir la parte superior del gel para hacer un sándwich de vacío. Coloque el sándwich de gel en una pantalla de fósforo de tungstato de calcio y exponer con un instrumento de proyección de imagen. El gel de nuevo con luz regular para saber dónde están los bordes del gel de la imagen.
   5. Utilice una software de procesamiento de imagen a superponer las dos imágenes. Alinee el gel a la imagen impresa. Utilice una nueva hoja de afeitar para cortar las bandas deseadas fuera el gel. Colocar rodajas de gel de 1 a 2 en un tubo de 1,7 mL.
      Nota: Asegúrese de que la imagen impresa tiene el mismo tamaño que el gel real. Verifique la alineación por proyección de imagen el gel sobrante otra vez después de cortar el trozo de gel.
   6. Recuperar el primer marcado con P ³²siguiendo los pasos 1.1.13 a 1.1.16. Tomar 1,0 μL de solución en un tubo de 0.4 mL y diluir la cartilla con tampón TE 1 x obtener la radiactividad de 1,0 μL en ~ 100.000 cpm. Almacenar la purificada ³²primer marcado con P a-80 ° C hasta que la reacción de modificación de RNA 2'-OH, pero durante no más de 4 semanas.
3. Enlace de molécula pequeña y modificación de 2'-OH del RNA
   1. Para preparar cuatro muestras, añadir 8 pmol RNA en 32 μL de tampón de TE x 0,5 a un tubo de 1,7 mL, calor a 80 ° C durante 2 minutos y snap-cool en hielo durante al menos 1 minuto.
      Nota: Utilice la siguiente ecuación para calcular el peso molecular aproximado de ARN: MW = (# de bases) x Da 340.
   2. Añadir 8 μL de 5 x plegable mix que contiene 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM de MgCl₂y 500 mM de NaCl. Alícuota 9 μL de la mezcla RNA en cada uno de la polimerización en cadena cuatro tubos y etiquetarlos #1-#4. Añadir 1 μL de 10% de DMSO en el tubo #1, 1 μL de solución de molécula pequeña concentrada (10% DMSO) en #2, 1 μL de solución de molécula pequeña diluida (10% DMSO) en #3 y 1 μL de agua en #4.
   3. Incubar los tubos PCR a 37 ° C en un termociclador durante 30 minutos.
   4. Justo antes de la reacción de modificación 2'-OH, diluir 1 μL de la solución madre de NAI (2 M) con 3 μL de agua tratada con DEPC para obtener una solución de 0.5 M de trabajo. Sin demora, añadir 1 μL de NAI solución diluida en tubos #1, #2 y #3 y 1 μL de DMSO 25% en #4. Incubar a 37 ° C en un termociclador durante 15 minutos.
   5. Añadir 100 μL de elución/precipitación de la mezcla (ver paso 1.1.13 para receta), 2 μL de glucógeno (15 mg/mL) y transfiera todo el líquido en cada tubo PCR en un tubo de 1,7 mL. Añadir 0,34 mL de EtOH 200 a prueba de helada (3 x volumen) en cada tubo. Mezclar con un vórtex para 5 s y coloque los tubos en un congelador de-80 ° C durante al menos 1 h.
      Nota: Durante este período empiezan a montar el gel de secuenciación que se utilizará en el paso 1.5.1.
   6. Centrifugar 15 min a 14.000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet de RNA. Lavar el pellet de RNA mediante la adición de 80% EtOH (0,5 mL por tubo), vortex por 15 s y centrifugar durante 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante nuevamente.
      Nota: Utilizar un contador Geiger para el pellet radiactivo en el tubo de retención.
   7. Secar el pellet de RNA para 5 minutos añadir 9 μL de agua libre de ARNasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
      Nota: No secar demasiado el pellet de RNA. Se espera que toda precipitación se disolvió al final de este paso.
4. Extensión de preparación y primer marcador
   1. Transferir el ARN modificado a 4 nuevos tubos PCR y etiquetarlos #1-#4 anteriormente. Agregar 2 pmol control RNA en 7 μL de agua tratada con DEPC a 4 tubos PCR adicionales y etiquetarlos #5 y #8. Añadir 2 μL de primer radiomarcado (paso 1.2.6) en todos los ocho tubos. Calor para cocer a 65 º C durante 5 minutos, luego enfriar inmediatamente a 4 ° C en el termociclador.
   2. Añadir 4 μL de 5 x buffer de RT (véase Tabla de materiales), 1 μL de Ditiotreitol (DTT, 0.1 M) y 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM) a cada uno de los ocho tubos PCR.
   3. Añadir 2 μL de tratada con DEPC H₂O a los tubos #1 y #4. Añadir 4 μL de ddATP (5 mM), 4 μL de ddTTP (5 mM) y 4 μL de ddCTP (5 mM) en los tubos #5 y #7, respectivamente. Añadir 1 μL de ddGTP (5 mM) y 3 μL de agua tratada con DEPC al tubo #8. Pipeta de cuatro veces para mezclar.
   4. Caliente a 52 ° C por 1 min en el termociclador. Añadir 1 μL de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales), luego mezclar mediante pipeteo arriba y abajo cuatro veces. Incubar la reacción a 52 ° C por 20 min.
   5. Añadir 1 μL de NaOH 5 de M en cada uno de los tubos para hidrolizar el ARN. Calentar los tubos a 95 ° C durante 5 minutos.
   6. Añadir 5 μL de 1 M de HCl y repetir la precipitación del etanol (pasos 1.3.5 y 1.3.6), excepto omita el glucógeno y la transferencia de líquidos.
      Nota: Omitiendo el paso 1.4.6 resultados en una región de desenfoque en el medio el gel conocido como "frente de la sal".
   7. Secar el pellet de ADN de 5 minutos agregar 10 μL de H₂O y 10 μL de 2 x TBE urea muestra carga buffer y pipetas arriba y abajo 10 veces para Redisuelva. Calor a 70 º C durante 5 minutos colocar los tubos en hielo antes de cargar en el gel.
5. Análisis de la página
   1. Para preparar un gel de secuenciación de poliacrilamida 8%, siga pasos 1.1.6 a 1.1.10 con las siguientes modificaciones: utilizar 100 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida de 40% (29: 1) para preparar una solución de acrilamida del 8% y utilizar placas de vidrio de gel de secuenciación (p. ej., 46 x 57 cm) con un espaciador de 0,4 mm.
   2. Cargar 10 μL de la muestra de paso 1.4.7. Correr el gel a 65 W para 2 horas o hasta que el tinte de abajo llegue a 3/4 del gel.
      Nota: Guarde el resto de las muestras a-80 ° C para repetir si es necesario.
   3. Retire la placa de vidrio siliconado superior quitando al separador y colocar suavemente una espátula. Coloque un pedazo grande de papel de filtro para cubrir el gel y presione suavemente para permitir que el gel se adhiere al papel de filtro. A partir del extremo inferior, levante el papel de filtro y retirar el gel de la placa de vidrio juntos.
   4. Coloque el gel junto con el papel de filtro en un pedazo de envoltura de plástico lo suficientemente grande para cubrir el gel entero (papel de filtro hacia arriba). Transferir el sándwich wrap gel/plástico/papel de filtro a un gel seco con el papel de filtro hacia abajo.
      PRECAUCIÓN: Para evitar contaminación del material radiactiva, usar 3 a 4 piezas más grandes de papel de filtro entre el sándwich de gel y gel seco.
   5. Secar el gel en 70 ° C por 1 h con un vacío. Transferir el sándwich de gel en una cinta de pantalla de almacenamiento de fósforo foto-blanqueado. Exponga la radiactividad del gel a la pantalla de 4 a 16 h.
   6. Coloque la pantalla de almacenamiento de fósforo en un dispositivo de proyección de imagen y escaneo con resolución media (~ 30 min).
      Nota: Si un sonrisa-como artefacto está presente en la imagen de gel, utilizar corrección software (por ejemplo, SAFA) para procesar la imagen a una calidad publicable. Tenga en cuenta que el carril estándar marcador es superior a los carriles de la modificación de 2'-OH de 1 nucleótido.

2. célula en forma

1. Primer diseño
   Nota: A diferencia de la forma in vitro, en células forma no necesita diseñar un casete de expresión. Sin embargo, un primer óptimo debe utilizarse y deberá ser evaluado antes de forma experimentar.
   1. Generar al menos tres pares de cartilla única por una herramienta de diseño de base de explosión (p. ej., explosión de cartilla). Para estudiar el pre-mRNA en células humanas, seleccionar el genoma humano (no transcriptoma) como una base de datos de referencia en cartilla par especificidad comprobación de parámetros. Escoge el tamaño del amplicón en el rango de 200 – 1.000 pares de base (PB).
   2. Extraer el ADN genómico de ~ 10⁶ células de interés con un método basado en la columna con el tratamiento de la Rnasa A y proteasa K (ver Tabla de materiales y utilizan el protocolo del fabricante). Normalizar el ADN genómico purificado en solución tampón TE de 0,1 μg/μL.
   3. Prueba de PCR con el protocolo se realiza en pasos de 1.1.1 y 1.1.2.
      Nota: El conjunto deseado de la cartilla debe generar una única banda en gel de agarosa al 1,8%.
2. Preparación y modificación de 2'-OH de la célula
   Nota: Para aumentar la abundancia del pre-mRNA de interés, un minigene con la secuencia correcta bajo promotor de citomegalovirus (CMV) de expresión constitutiva es transfected en las células hospedadoras.
   1. Caliente previamente el medio de cultivo con 10% suero bovino fetal (FBS) y mezcla antibiótica de 1 x en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) a 37 ° C. Células 293T de semilla en el 50% de confluencia 24 h antes de la transfección en medio de cultivo. Cambiar el medio en el 2% FBS en DMEM sin antibióticos ~ 1 h antes de la transfección.
   2. Añadir 10 μg de plásmido minigene en 100 μL de suero reducido los medios de comunicación (véase Tabla de materiales) en 1 pozo de una placa de 96 pocillos. Pipetear la solución arriba y abajo cuatro veces para mezclar.
   3. Agregar 40 μL de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) en 100 μL de medios suero reducido en otro pocillo de la placa. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   4. Añadir la solución completa del plásmido a la suspensión del reactivo de transfección. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   5. Añadir la DNA entera / mezcla de reactivo de transfección gota a gota sobre la superficie del medio en el plato. Incubar a 37 ° C durante 6-12 h.
   6. Aspire el medio y lave suavemente una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, sin CaCl₂ y MgCl₂, véase Tabla de materiales). Trypsinize las células con 3 mL de solución de tripsina. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   7. Golpee el plato suavemente para disociar las células de la parte inferior del plato. Neutralizar la tripsina con 6 mL de medio de cultivo. Centrifugar a 300 x g durante 4 minutos y quitarlo del medio.
   8. Resuspender las células de⁶ ~ 10 para cada muestra en 199 μL del medio de reacción (1% FBS en DMEM) y transferir la suspensión de células en una placa de 96 pocillos. Incubar las células con 1 μL de solución de trabajo de compuesto o 1 μL de DMSO en todos los tres controles durante 30 min a 37 ° C.
      Nota: Tres muestras de control debe incluidas: control de DMSO con NAI, RNA desnaturalizado y NAI, NAI control negativo.
   9. Añadir 10 μL de NAI de 2 M a cada muestra, excepto para los controles negativos de NAI y desnaturalización control (DC) RNA. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a 37 ° C por 15 minutos agitar suavemente las placas para resuspender las células cada 5 min.
   10. Transferir las células a 1,7 mL tubos y centrifugar a 400 x g durante 2 min sin demora. Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
   11. Agregar 0,4 mL de tiocianato de guanidinio (véase Tabla de materiales). Vortex por 15 s para homogeneizar. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos.
       Nota: Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta proceder al paso siguiente.
3. Extracción de RNA
   1. Añadir 0,2 mL de cloroformo a cada una de las muestras de homogeneizado de tiocianato de guanidinio. Vortex por 15 s. incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
   2. Centrifugar durante 5 min a 12.000 g y 4 ° C. La capa acuosa incolora superior contiene RNA. Transferir ~ 380 μL de solución acuosa a un tubo nuevo de 1,7 mL.
      PRECAUCIÓN: No molestes a la interfase para evitar la contaminación.
   3. Añadir 1,5 x volumen de EtOH (~ 570 μL). Vortex por 15 s para mezclar.
   4. Transferir 600 μL de mezcla de RNA en una aislamiento de RNA spin-columna (véase Tabla de materiales). Centrifugar a 12.000 x g durante 15 s. descarte el eluyente. Repita este paso para pasar a través de todo el líquido en la misma columna de vuelta.
   5. Lavar la columna con 0,35 mL de tampón RW1 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s. Añadir 80 μL de DNasa Rnasa-libre en tampón de RDD (véase Tabla de materiales). Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
      Nota: Es fundamental para eliminar toda contaminación del ADN.
   6. Posteriormente se lava la columna con 0,35 mL de tampón RW1 y 0,6 mL de tampón de x RPE 2 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s en cada paso. Seque la columna por la columna de vuelta con un tubo de colección vacía a 12.000 x g durante 1 min la centrifugación.
   7. Añadir 32 μL de agua libre de ARNasa al centro de la columna. Incubar durante 1 minuto centrifugar a 12.000 x g durante 30 s para obtener 30 μL de la solución de RNA purificado. Poner las muestras a-20 ° C durante el procesamiento de la muestra desnaturalizada.
4. Preparación de control de RNA desnaturalizado
   1. Muestra de RNA lugar 30 μL para la C.C. en un tubo de plástico de 1,7 mL de hielo. Añadir 50 μL de formamida y 15 μL de tampón de DC que contiene 300 mM HEPES (pH 8.0) y 25 mM EDTA en el tubo.
   2. Calor para desnaturalizar rápidamente el RNA a 95 ° C durante 1 minuto añadir 5 μL de solución stock de NAI (2 M), a continuación, película dos veces para mezclar y colocar el tubo de nuevo en el bloque calefactor. Incubar a 95 ° C durante un 1 minuto adicional y poner inmediatamente el tubo en hielo.
   3. Agregar 0,4 mL de tiocianato de guanidinio. Repita los pasos 2.3.1–2.3.4.
   4. Lavar la columna con 0,6 mL de tampón de x RPE 2 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s en cada paso. Seque la columna por la columna de vuelta con un tubo de colección vacía a 12.000 x g durante 1 min la centrifugación.
   5. Añadir 32 μL de agua libre de ARNasa al centro de la columna. Incubar durante 1 minuto centrifugar a 12.000 x g durante 30 s para obtener 30 μL de solución de RNA DC recuperado.
5. Extensión de la cartilla
   1. Normalizar la solución de RNA de 2.3.7 y 2.4.5 en 0,5 μg/μL con agua libre de ARNasa. Recién preparar 30 mM MnCl₂ solución de MnCl₂∙4H₂O en polvo.
   2. Transferencia 9 μL de solución de RNA para cada muestra en una tira PCR. Añadir 1 μL de dNTP 10 mM y 1 μL de 2 cartilla gene-específica μM (SGP) en cada tubo. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a 65 ° C durante 5 minutos en un termociclador y puesto en el hielo de > 1 minuto.
      Nota: Alternativamente, puede utilizarse 1 μL de al azar nonamer en sustitución del SGP.
   3. En cada tubo PCR, agregar una mezcla de 2 μL de 10 x buffer de RT (véase Tabla de materiales), 4 μL de 30 mM MnCl₂y 2 μL de 100 mM DTT. Pipetear arriba y abajo 4 x para mezclar. Incubar a 42 ° C por 2 min.
   4. Añadir 1 μL de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales). Pipetear arriba y abajo 4 x para mezclar. Incubar a 42 ° C en un termociclador durante 3 horas.
6. Preparación de la biblioteca y secuenciación de próxima generación
   1. Establecer una reacción de PCR mediante la adición de 1 μL de ADN polimerasa, 5 μL de 10 x buffer de polimerasa de la DNA (véase Tabla de materiales), 2 μL de DMSO, 1,5 μL de cada uno de los iniciadores (10 μM), 34 μL de H₂O y 5 μL de cDNA de paso 2.5.4.
   2. Configurar el termociclador como sigue: etapa 1) 95 ° C por 2 min; etapa 2) 95 ° C por 30 s; etapa 3) 60 ° C por 30 s; etapa 4) 68 ° C por 30 s; lazo de la etapa 5) hacia la etapa 2 durante 30 ciclos; etapa 6) 68 ° C por 3 min; y fase 7) infinito sostiene a 4 ° C hasta que el siguiente paso.
   3. Purificar los productos mediante el uso de gel de agarosa al 1,8%.
      Nota: La banda PCR debe aparecer como una única banda en el gel.
   4. Construcción de la biblioteca mediante fragmentación estándar y métodos de ligadura en la literatura^6,26.
   5. Secuencia en un equipo de secuenciación de última generación utilizando 1 x 75 solo extremo Lee para generar aproximadamente 10 millones Lee por muestra.
   6. Analizar los resultados usando ShapeMapper y software SuperFold paquetes desarrollados por las semanas del grupo²⁶.

Previamente demostramos que un RNA splicing modulador, SMN-C2, interactúa con motivo de la AGGAAG en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2 y utilizó la forma para evaluar los cambios estructurales del RNA en presencia de SMN-C26. El sitio de unión del SMN-C2 es distinto de los oligonucleótidos antisentido aprobado por la FDA (ASO) para el SMA, nusinersen, que se une y bloquea el silenciador que empalma intronic (ISS) en el intrón 727,28 (figura 1A). Más conocidos reguladores de empalmes del exón 7 de SMN2 están dentro del rango de ~ 100 nucleótidos del exón 7 en el pre-mRNA29; por lo tanto, un ARN de nucleótido-largo 140 y 276 secuencias fueron utilizadas de forma in vitro y en células, representativo, que cubre el exón 7 y en la región del intrón adyacente (figura 1A).

En este análisis representativos de forma in vitro, la secuencia de RNA de interés está incrustada en un casete optimizado desarrollado por el laboratorio de semanas, que es compatible para la mayoría de secuencias de RNA1. En ocasiones, la secuencia de interés interactúa o interfiere con este cassette. En estos casos, se puede utilizar un cassette modificado con las siguientes tres características: i) un sitio de unión del primer específico de extremo 3' con una afinidad de hibridación más eficiente para la cartilla que cualquier parte de la secuencia de RNA, ii) un lazo de horquilla altamente estructurado encuentra directamente aguas arriba del sitio de unión del primer que muestra específica y reproducible señal forma (esto actuará como un control para el experimento y el método para alinear la señal de un experimento a experimento tanto interno) y iii) una estructura de horquilla de 5'-end elemento, que indica el final de la señal de la forma. El cartucho de forma aún más está flanqueado con auto hendiendo ribozyme secuencias en ambos 5'- y 3' extremos para generar una homogénea de RNA30. Se encontró que el martillo y hepatitis delta virus ribozimas son compatibles para el cartucho de forma y suele dan alto rendimiento del ARN deseado. La plantilla resultante RNA tiene un extremo 3' de la 2', 3'-cíclica fosfato y un extremo 5' del grupo del oxhidrilo, que no interfieran con la extensión de la cartilla. Una larga secuencia de nucleósidos 140 cubriendo el exón 7 de SMN2 y región adyacente en el pre-mRNA fue sintetizada en forma y ribozyme del cassette como se ilustra en el esquema 1.

En general, la secuencia de interés ligada en el casete de expresión debe ser lo suficientemente largos para cubrir la orden de secundaria o superior potencial de estructura. En el caso de SMN2 exón 7, una región de 140-nucleótido contiene dos estructuras de lazo del vástago6,31. La estructura de la región de interés varía de caso por caso y debe ser evaluada por ensayo y error.

Gel de secuenciación de poliacrilamida con 32productos de la extensión de primer etiquetado P fue elegido para visualizar el perfil en vitro forma en este experimento representativo. Un método de visualización alternativa es utilizar electroforesis capilar con fluorescencia etiquetada DNA cartilla32. En geles de secuenciación de poliacrilamida, nucleósidos ~ 20 cerca del extremo 5' y ~ 10 nucleótidos cerca del extremo 3' de la secuencia de RNA de interés no se visualizar cuantitativamente, debido a de vez en cuando se detiene en los pasos de iniciación de transcripción inversa e intenso bandas en geles de la página para transcripciones integrales1.

Una forma alternativa para la recuperación de gel preparativo de una plantilla de RNA (pasos 1.1.6 a 1.1.12) es sobrecargar un mini-gel si el rendimiento de la plantilla deseada de RNA es > 90%. Se aconseja retirar el NTP exceso del producto de RNA por la columna de la desalación y liberador del RNA en 50 μl de tampón TE. Medir la concentración del RNA y carga 5.0 μg en cada pozo. Durante la purificación el paso de la T7 transcrito plantilla del RNA, la página cuando el tinte de cyanol FF de xileno (azul claro) pasado dos tercios de los 6% desnaturalizado gel TBE urea. El fragmento de RNA de uno mismo-escote (< 80 nucleósidos) pasado por el gel, que dejó el ARN deseado como la única gran banda en el gel por tinción (figura 1B).

SMN-C2 (figura 1) se sintetiza según el procedimiento publicado33 y disuelto en la solución stock de 10 mM DMSO. La solución es más diluida en 500 y 50 μm en solución al 10% DMSO para obtener concentraciones finales de 5 y 50 μm, respectivamente. Snap-refrescado RNA replegado a su etapa de equilibrio en presencia de DMSO o SMN-C2 dentro de 30 minutos a 37 ° C. Un tiempo de incubación no cambió el resultado del experimento. Dos muestras experimentales (5 y 50 μm SMN-C2), dos controles (DMSO y NAI-controles), y cuatro marcadores (A, T, G, C) fueron tratados para la extensión de la cartilla. Después de exponer el gel a la pantalla de almacenamiento de fósforo, se mostrará un exitoso experimento de la forma: i) una banda única y más intenso en la parte superior del gel y ii) bandas en el gel de resolución del solo-nucleótido sin frotis (figura 1). Un problema común en el análisis de la página es que una región de borrón de transferencia conocida como "frente de la sal" puede aparecer en el gel (Figura 1E). Esto es probablemente debido a la alta concentración de sal, DMSO, u otros no deseados sustancia en la muestra de carga que puede ser removida por precipitación del etanol.

En in vitro forma una plantilla de RNA pura es la clave para un exitoso experimento. Una plantilla de RNA impura es generalmente la causa de resultados no deseados. Si el análisis de la página muestran claramente un patrón de 2 juegos de marcadores, indica que la plantilla del RNA no es homogénea y tiene casco por preparativo TBE urea gel.

Para la forma en las células, una clave para un exitoso experimento es diseñar un conjunto optimizado de primer para la amplificación. Con 0.10 μg de plantilla de cDNA libre de DNA genómico, se debe observar una única banda en 25 ciclos PCR en gel de agarosa al análisis. Por lo tanto deben evitarse las secuencias repetitivas del intrón. Para estudiar la estructural fue probado impacto de SMN-C2 en SMN2 pre-mRNA, tres conjuntos de cartilla (tabla 2), y todos fueron satisfactorios (figura 2A).

Un número de una secuencia de destino RNA copias bajo es generalmente un problema de forma en las células. Para enriquecer el RNA de interés, un minigene que contiene la secuencia de RNA de interés bajo un fuerte promotor del CMV fue transfected en las células 293T. Porque el patrón de corte y empalme del minigene de SMN2 recapitula de SMN2 endógeno con o sin SMN-C219,34, tenemos la visión de que la estructura del SMN-C2 interacción ARN en overexpressed SMN2 pre-mRNA probablemente era el mismo que el producto del gen endógeno. Mientras que la EC50 de SMN-C3 en el ensayo que empalmaba fue ~0.1 μm6,19, una concentración en el extremo superior (20 μm) se utilizó para garantizar el estado de la Unión de la molécula pequeña y la secuencia de destino RNA.

A aislamiento del ARN, cartillas gene-específico y al azar pueden utilizarse para extensión. En el caso del exón 7 de SMN2, encontramos que SMN2E7-338-RV (tabla 2) produce una mayor copia de cDNA deseado que una aleatoria nonamer, evidenciado por una banda más intensa en la amplificación de la polimerización en cadena con sistema de cartilla de SMN2E7-276 (tabla 2) después de 25 ciclos. En el paso 2'-OH de modificación, una concentración de NAI final 91 μm fue utilizado para un período de incubación de 15 minutos. Si se utiliza un tipo de células diferentes o medio, el tiempo de incubación debe ser re-optimizado. Si el tiempo de incubación es muy largo, análisis de gel de agarosa de los productos a veces no muestran una banda.

Un programa basado en python, ShapeMapper, desarrollado por las semanas de laboratorio35 se utilizó para analizar los datos generados mediante la secuenciación de nueva generación [para datos del SMN-C2 tratado celdas forma de SMN2 exón 7 pre-mRNA, se refieren a la secuencia de lectura archivo (SRA) base de datos]. A lo largo de los productos, la reactividad de forma no significativamente cambió (> 1), que indica que la estructura secundaria se mantiene en presencia de SMN-C2 (figura 2B). Esto también es confirmado por las parcelas de arco generadas por SuperFold35. Las líneas de conexión indican el posible emparejamiento base basa en forma de actividad de cada nucleótido. Modelado de RNA tratado SMN-C2 y DMSO es esencialmente el mismo (figura 2). Diferencial en células forma reactividad se calculó para cada nucleótido (figura 2B), y el cambio de reactividad más ocurrió en TSL-1 (5'-final del exón 7) pero no TSL-2 (3'-final del exón 7). Este resultado está de acuerdo con el forma in vitro; Aunque la base que se aparea cambió de vitro en modelado de la forma ARN en la forma en la célula analiza (Figura 2D).

Un problema común de la forma en las células es el índice bajo de mutación a lo largo de los amplicones. Esto es generalmente debido a la contaminación de ADN genómica. ADN no contiene grupo 2'-OH; por lo tanto, ningún producto de acilación está formado con NAI. Amplificación por PCR así simplemente refleja el índice bajo de mutación de la polimerasa de la DNA. Aislamiento de ARN por tiocianato de guanidinio, seguido por digestión de la ADNsa en columna es suficiente para eliminar todo ADN en la mayoría de los casos. Si la contaminación del ADN persiste, repita el paso 2.3 para el aislamiento de RNA.

Esquema 1: secuencia de la DNA de la plantilla de transcripción del RNA. La secuencia de bp 12 dentro de la secuencia de ribozima Hammerhead virus en rojo es el complemento reverso de los primeros 12 bp del cassette de 5'. La secuencia de RNA de interés presentados en este documento es un 140 secuencia de pre-mRNA de bp contiene el exón 7 del gen SMN2 humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1: Diseño experimental y el resultado de la forma in vitro de SMN2 exón 7 pre-ARNm en presencia de SMN-C2. (A) Descripción de la secuencia de interés para los estudios de forma in vitro y en células del gen SMN2. SMN-C2 se une al motivo AGGAAG en el exón 7, un lugar distinto del sitio de unión del nusinersen. (B) purificación del producto de transcripción T7. Cada uno de los tres carriles que contiene 5.0 μg de ARN crudo. El gel de urea de TBE fue teñido con SYBR-Safe (1:10, 000) durante 5 minutos en buffer de x TBE 1. Caja roja discontinua indica el borde de la escisión para la recuperación de RNA. (C) la estructura del SMN-C2. Plantilla del RNA de la nucleótido-largo (D) experimento de forma In vitro con NAI y un 140 que contienen el exón 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = falta de NAI; 5-8 = escaleras generados por la adición de ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP durante la extensión de la cartilla. Página fue llevada hacia fuera en un gel de secuenciación de TBE urea en 60 W de 3 h. rojo asteriscos indican intensidad de banda mayor con 50 μm SMN-C26. (E) un ejemplo de una región de "frente de la sal" en la caja roja discontinua de otro experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: FORMA en las células derivadas modelos RNA de SMN2 exón 7 pre-mRNA. (A) PCR amplificación con todos los conjuntos de primer tres (tabla 2) cedida una sola banda en el análisis de gel de agarosa. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = escalera de ADN. (B) diferencial reactividad de forma en las células en células 293T transfectadas minigene SMN2 μm 10 SMN-C2 y DMSO en TSL1. Reactividad de la forma en la resolución del solo-nucleótido. ShapeMapper software35se calculó su desviación estándar. Los asteriscos verdes indican cambio significativo de la reactividad de forma inducido por el μm 10 SMN-C2. La numeración de los nucleótidos en el 276 amplicon bp aparece en x-eje. Barras de error se estimaron de forma-Mapper software26. (C) parcela de arco generada por SuperFold35 para la estructura secundaria del RNA más plausible de modelado de datos de forma en las células. (D) Modelado forma dirigida In vitro y en células del exón 7 y regiones adyacentes. Para el modelo de RNA in vitro, forma de estabilización de cassette (naranja) y nucleótidos (azul) 1-19 se muestra en bosquejo. Para el modelo de RNA en las células, numeración de nucleótidos está alineada con la plantilla de forma in vitro. Se omitieron los nucleótidos 1-18 y 120-140. Cambios significativos de reactividad se indican en asteriscos rojos y verdes de forma in vitro y en células, respectivamente. Las estructuras secundarias que anteriormente fueron nombradas TSL1 y TSL231 están encerradas en cajas azules. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Las secuencias de la cartilla utilizadas en el experimento representativo.

Tabla 2: establece la cartilla para la amplificación de la secuencia de pre-ARNm de interés. Todos los conjuntos de tres primer rendir un solo amplicon en una reacción de PCR con plantilla de cDNA genomic DNA libre.

Los autores no declaran conflicto de intereses.