Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.
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Artículo de método
Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo nos detalladamente un método para obtener fracciones subcelulares de las células U937 sin el uso de ultracentrifugación o indiscriminadas detergentes. Este método utiliza buffers hipotónicas, digitonin, lisis mecánica y centrifugación diferencial para aislar el citoplasma, mitocondrias y membrana plasmática. El proceso puede escalarse para satisfacer las necesidades de los investigadores, es barato y sencillo. Este método permitirá a los investigadores a determinar la localización de la proteína en células sin centrífugas especializadas y sin el uso de kits comerciales, los cuales pueden ser prohibitivos. Hemos utilizado con éxito este método para separar citosólica, membrana del plasma y proteínas mitocondriales en la línea de celular del monocito humana U937.
Introducción
Identificación confiable de la localización de la proteína es a menudo necesaria al examinar vías moleculares en las células eucariotas. Métodos para obtener fracciones subcelulares son utilizados por los investigadores a examinar más de cerca los componentes celulares de interés.
La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular existentes cae generalmente en dos amplias categorías, a base de detergente1,2 y basado en la ultracentrifugación3,4,5, que puede ser diferenciados por la veloc....
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Protocolo
1. preparación de tampones y reactivos
Nota: Vea la tabla 1.
- Preparar soluciones de tampón de lisis B, tampón, tampón A y digitonin.
- Preparar el tampón A agregando 8,77 g de NaCl y 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
Nota: Concentraciones finales son 150 mM de NaCl y 50 mM HEPES. - Preparar el tampón de lisis B añadiendo 20 mL de HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl2, 2 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA de 0,5 M), 2 mL de etilenglicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacético á....
- Preparar el tampón A agregando 8,77 g de NaCl y 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
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Resultados
Fraccionamiento exitoso de células indiferenciadas de la8 de U937 cultivadas en suspensión fue logrado usando el protocolo detallado arriba e ilustrado en la figura 1. Las muestras obtenidas con este método fueron sometidas a western blot9 utilizando un método de transferencia mojado a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro. La membrana fue posteriormente explorada con anticuerpos contra citoplasmátic.......
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Discusión
El desarrollo de este protocolo surge de la incapacidad de separar mitocondrial y las muestras de la membrana, usando kits disponibles en el mercado, para el análisis de la localización de la proteína durante la necroptosis14. Las limitaciones primarias de kits prefabricados son su incapacidad para adaptarse a las necesidades de los investigadores individuales, su costo por muestra y el número limitado de muestras capaces de ser procesados. El método presentado aquí se puede realizar sin el uso de.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses
Agradecimientos
Trabajo fue financiado por los NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | para la extracción de citoplasma |
| D-manitol | Sigma-Aldrich | M4125 | para tampón de lisis B |
| Homogeneizador de onzas | VWR | 22877-282 | para homogeneización |
| rotador de extremo a extremo | Barnstead | N/A | citoplasma |
| etilenglicol-bis(β-aminoetílicoéter)-N,N,N' ,Ácido N'-tetraacético (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | Para tampón de lisis B |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Para tampón de lisis B |
| GAPDH (14C10) | Tecnologías de señalización celular | 2118 | Para la detección de fracciones citoplasmáticas en Western blot, dilución: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | Para tampones de lisis A y B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Para tampón de lisis B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | Para tampón de lisis B |
| Na, K-ATPasa a1 (D4Y7E) | Tecnologías de señalización celular | 23565 | Para la detección de fracciones de membrana plasmática en Western blot, dilución: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | para tampón de lisis A |
| fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF) | VWR | M145 | para la extracción y homogeneización de citoplasma tampón |
| sonicador de sonda | Qsonica | Q125-110 | Para muestras finales |
| cóctel de inhibidores de proteasa, uso general | VWR | M221-1ML | para extracción de citoplasma |
| centrífuga refrigerada | Beckman-Coulter | N/A | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | VWR | 227 | Para tampón de muestra |
| ortovanadato de sodio (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | para tampones de lisis A y B |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | para tampón de lisis B |
| solución salina tamponada con tris (TBS) | VWR | 788 | para tampón de muestra |
| VDAC (D73D12) | Tecnologías | de señalización celular4661 | Para la detección de fracciones mitocondriales en Western blot, dilución: 1:1000 |
Referencias
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K.
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Reimpresiones y permisos
