Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

Summary

El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.

Abstract

El hueso es un tejido conectivo constituido por osteoblastos, osteocitos y osteoclastos y una matriz extracelular mineralizada, que le da su fuerza y flexibilidad y le permite cumplir sus funciones. El hueso está continuamente expuesto a una variedad de estímulos, que en condiciones patológicas pueden desregular la remodelación ósea. Para estudiar la biología ósea y las enfermedades y evaluar posibles agentes terapéuticos, ha sido necesario desarrollar modelos in vitro e in vivo.

Este manuscrito describe el proceso de disección y las condiciones de cultivo de las calvarias aisladas de ratones neonatales para estudiar la formación ósea y el microambiente tumoral óseo. A diferencia de los modelos in vitro e in vivo, este modelo ex vivo permite la preservación del entorno tridimensional del tejido, así como la diversidad celular del hueso mientras se cultúa en condiciones definidas para simular el microambiente deseado. Por lo tanto, es posible investigar la remodelación ósea y sus mecanismos, así como las interacciones con otros tipos de células, como las interacciones entre las células cancerosas y el hueso.

Los ensayos aquí indicados utilizan calvarias de ratones BALB/C de 5-7 días de edad. Los hemi-calvarias obtenidos se cultivan en presencia de insulina, células de cáncer de mama (MDA-MB-231) o medio acondicionado de cultivos celulares de cáncer de mama. Después del análisis, se estableció que la insulina indujo nueva formación ósea, mientras que las células cancerosas y su resorción ósea inducida media condicionada. El modelo calvarial se ha utilizado con éxito en la investigación básica y aplicada para estudiar el desarrollo óseo y las enfermedades óseas inducidas por el cáncer. En general, es una excelente opción para un ensayo fácil, informativo y de bajo costo.

Introduction

El hueso es un tejido conectivo dinámico que tiene varias funciones, incluyendo el apoyo a los músculos, la protección de los órganos internos y la médula ósea, y el almacenamiento y liberación de calcio y factores de crecimiento^1,,2. Para mantener su integridad y función adecuada, el tejido óseo está continuamente bajo el proceso de remodelación. En términos generales, un ciclo de remodelación ósea se puede dividir en resorción ósea y formación ósea¹. Un desequilibrio entre estas dos fases de remodelación ósea puede conducir al desarrollo de patologías óseas. Además, enfermedades como el cáncer de mama a menudo afectan la integridad ósea; aproximadamente más del 70% de los pacientes en etapas avanzadas tienen o tendrán metástasis óseas. Cuando las células de cáncer de mama entran en los huesos, afectan el metabolismo óseo, lo que resulta en una resorción excesiva (lesiones osteoclásticas) y/o formación (lesiones osteoblásticas)³.

Para entender la biología de las enfermedades óseas y desarrollar nuevos tratamientos, es necesario entender los mecanismos involucrados en la remodelación ósea. En la investigación del cáncer, es esencial investigar el proceso de metástasis ósea y su relación con el microambiente metastásico. En 1889, Stephen Paget hipotetizó que las metástasis ocurren cuando hay compatibilidad entre las células tumorales y el tejido diana, y sugirió que el sitio metastásico depende de la afinidad del tumor para el microambiente^4. En 1997, Mundy y Guise introdujeron el concepto del "círculo vicioso de metástasis óseas" para explicar cómo las células tumorales modifican el microambiente óseo para lograr su supervivencia y crecimiento, y cómo el microambiente óseo promueve su crecimiento proporcionando calcio y factores de crecimiento^5,,6,,7.

Para caracterizar los mecanismos implicados en la remodelación ósea y metástasis ósea y para evaluar moléculas con posible potencial terapéutico, ha sido necesario desarrollar modelos in vitro e in vivo. Sin embargo, estos modelos presentan actualmente muchas limitaciones, como la representación simplificada del microambiente óseo, y su costo^8,9. El cultivo de explantes óseos ex vivo tiene la ventaja de mantener la organización tridimensional, así como la diversidad de células óseas. Además, se pueden controlar las condiciones experimentales. Los modelos explantatos incluyen el cultivo de huesos metatarsales, cabezas femorales, calvarias y núcleos mandibulares o trabeculares^10. Las ventajas de los modelos ex vivo se han demostrado en diversos estudios. En 2009, Nordstrand y colaboradores informaron del establecimiento de un modelo de cocultura basado en las interacciones entre las células de cáncer de hueso y próstata¹¹. Además, en 2012, Curtin y sus colaboradores informaron del desarrollo de un modelo tridimensional utilizando los coculturas ex vivo ^12. El objetivo de estos modelos ex vivo es recrear las condiciones del microambiente óseo con la mayor precisión posible para poder caracterizar los mecanismos implicados en la remodelación ósea normal o patológica y evaluar la eficacia de los nuevos agentes terapéuticos.

El presente protocolo se basa en los procedimientos publicados por Garrett¹³ y Mohammad et al.¹⁴. Los cultivos de calvaria sómico se han utilizado como modelo experimental, ya que conservan la arquitectura tridimensional del hueso en desarrollo y las células óseas, incluyendo células en todas las etapas de diferenciación (es decir, osteoblastos, osteoclastos, osteoclasocitos, células estromales) que conducen a osteoclastos maduros y osteoblastos, así como a la matriz mineralizada¹⁴. El modelo ex vivo no representa totalmente el proceso patológico de las enfermedades óseas. Sin embargo, los efectos sobre la remodelación ósea o la osteolisis ósea inducida por cáncer se pueden medir con precisión.

Brevemente, este protocolo consta de los siguientes pasos: la disección de calvarias de ratones de 5-7 días de edad, precultivo de calvaria, aplicaciones de cultivo de calvaria (por ejemplo, cultivo en presencia de insulina, células cancerosas o medio condicionado, e incluso agentes con potencial terapéutico, según el objetivo de la investigación), fijación ósea y descalcificación calvaria, procesamiento de tejidos, análisis histológico e interpretación de resultados.

Protocol

Todos los ratones utilizados en estos ensayos se obtuvieron de cepas de ratones BALB/c, utilizando ratones machos y hembras indiscriminadamente. También se han realizado experimentos de cultivo previos utilizando otras cepas, como FVB, ratones suizos, CD-1 y ratones CsA^11,,12,,14. Todos los ratones fueron alojados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), Apéndice Q. Los procedimientos relacionados con sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro de Investigación Científica y Educación Superior de Ensenada (CICESE).

1. Disección calvarial

1. Esterilice los instrumentos de disección (p. ej., fórceps de tejido de 1 x 2 dientes, tijeras quirúrgicas rectas, tijeras de disección, pinzas de punta fina, fórceps de disección de punta curva fina, fórceps disidentes, bisturí). El agua destilada estéril se puede utilizar para limpiar las herramientas quirúrgicas entre cada disección, y se puede utilizar 1 pbS estéril para limpiar cada hemi-calvaria.
2. Coloque los instrumentos de disección estériles, agua, 1pbS y los materiales necesarios para llevar a cabo el procedimiento (por ejemplo, micropipetas, vasos precipitados, platos estériles de Petri) en una campana de flujo laminar.
   NOTA: Lleve a cabo todo el procedimiento en condiciones estériles.
3. Añadir 12 ml de 1x PBS estéril en dos platos Petri de 10 cm.
4. Seleccione los cachorros y colóquelos cerca del capó.
   NOTA: Diseccionar las calvarias de cachorros de 5-7 días de edad.
5. Escoja y sostenga el ratón cuidadosamente usando fórceps disecantes.
6. Decapita el ratón usando tijeras disecantes y coloca la cabeza en un plato de Petri con PBS.
   NOTA: La decapitación no es adecuada para ratones mayores. Si el experimento debe realizarse con ratones más viejos, el método de eutanasia debe modificarse de acuerdo con las reglas de experimentación animal.
7. Sostenga la cabeza firmemente por el área de la nariz con 1 x 2 fórceps de tejido dental y retire la piel sobre el cráneo hasta que la calvaria sea visible.
8. Identifique las suturas (es decir, sagital, coronal y lambdoid) del cráneo en la calvaria expuesta.
9. Penetra con la punta de las microtijeras aproximadamente 2 mm detrás de la sutura lambdoid y haz un corte recto junto a ella.
10. Inserte la punta de las microtijeras en la parte posterior del cráneo. Haga un corte recto a lo largo del lado distal de la sutura lambdoid hacia la sutura coronal. Proceda de manera similar con la otra sutura lambdoid.
11. Realice otro corte (en un ángulo de 45o) para conectar el extremo del corte realizado con el corte del fontanel anterior.
12. Repita los pasos 1.10 y 1.11 con la otra sutura lambdoid.
    NOTA: Es importante identificar las suturas para realizar cortes adecuados y poder realizar una adecuada incrustación y análisis de datos.
13. Use fórceps de punta fina para eliminar la calvaria y colocarla en un plato de Petri. Con un bisturí, haz un corte recto desde el fontanel posterior a lo largo de la sutura sagital a través de la sutura coronal y terminando en el fontanel anterior para obtener dos hemivarias.
14. Recoja cada una de las hemi-calvarias con las pinzas de punta fina y colóquelas en un nuevo plato de Petri que contenga PBS.

2. Cultivo calvaria

1. Añadir 1 ml de medio DMEM de alta glucosa suplementado con 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 1% antibiótico/antimicótico (es decir, penicilina y estreptomicina) en los pozos de una placa de 24 pocillos. Con fórceps de punta fina, recoge cada hemi-calvaria y colócalo en un pozo.
   NOTA: Coloque el lado cóncavo hemi-calvarias hacia abajo.
2. Incubar las hemi-calvarias durante 24 h a 37oC con un 5% de_CO2.
3. Retire el medio de cultivo de cada poca y agregue 1 ml de medios frescos que contengan el compuesto para probar o acondicionar los medios de otras células.
   NOTA: Utilice al menos tres hemi-calvarias para cada grupo de tratamiento y utilice controles negativos y positivos.
4. Incubar los hemi-calvarias durante 7 días, cambiando los medios cada 2-3 días.

3. Cultivo con células cancerosas

1. Seleccione un plato de Petri con células cancerosas al 80-90% de confluencia y taíquelas. Para trippsinizar, lave las células cancerosas 1veces con PBS (5 ml por matraz de 75 cm²⁾ seguido de la incubación en una solución de HBSS que contenga 0,05% de trippsina y 0,53 mM de EDTA (2 ml por matraz de 75 cm^2).
2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
3. Retire y deseche el sobrenadante.
4. Resuspenda el pellet en 2 ml de DMEM que contenga un 2% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de antibióticos/antimicóticos. Cuente las células vivas.
5. Asignar hemi-calvarias a cada grupo de estudio (es decir, el grupo de control negativo y cocultura para el ANÁLISis de ARN o histología).
6. Retire los medios de cultivo de las hemi-calvarias y agregue 1 ml de DMEM que contenga 2% de FBS y 1% de antibióticos/antimicóticos complementados o no suplementados con células cancerosas.
   NOTA: La cantidad de celdas que se van a agregar puede cambiar dependiendo de la línea de celda probada. Con células cancerosas como MDA-MB-231 o PC-3, 500.000 células por pozo funcionan adecuadamente.
7. Incubar durante 24 h a 37oC con 5% de_CO2. Pasar cada hemi-calvaria a un nuevo pozo para retener sólo las células cancerosas que se adhirieron al tejido óseo.
8. Incubar durante 7 días a 37oC con 5% de_CO2 y cambiar los medios cada 2-3 días.

4. Fijación

1. Corte los cuadrados de papel tisú para envolver los hemi-calvarias.
   NOTA: También se pueden utilizar almohadillas de espuma de biopsia o cápsulas de acero para biopsias pequeñas.
2. Use fórceps rectos de punta fina para recoger cada hemi-calvaria de la sutura sagital, colocar sobre un papel tisú y envolver.
3. Coloque el hemi-calvaria envuelto dentro de un casete incrustado etiquetado.
4. Coloque el cassette en un recipiente con una formalina con fosfato del 10%.
5. Fijar durante 24 h a 4oC.

5. Descalcificación

1. Retire la formalina, agregue 1 x PBS y agite los tejidos durante 30 minutos para enjuagar los hemi-calvarias.
2. Retire el PBS y agregue 10% EDTA (pH a 8, 0,34 M).
   NOTA: Compruebe que la solución cubra completamente los tejidos.
3. Descalcificar los tejidos durante 48 h a 4oC.
4. Deseche la solución EDTA y agregue 1 x PBS para enjuagar el tejido.
5. Almacenar las hemi-calvarias en 70% de etanol hasta el procesamiento histológico.

6. Procesamiento de tejidos

1. Deshidratar los tejidos con rondas de etanol 96%, 60 min (3x), seguido de 100% etanol, 60 min (3x).
2. Reemplace el etanol por 100% xileno, 60 min (3x).
3. Incubar los cassettes en cera de parafina, 60 min (2x).

7. Incrustar

1. Abra los cassettes, retire cuidadosamente el papel tisú y desenvuelva la calvaria.
2. Recoge cada calvaria cuidadosamente y apila todos los hemi-calvarias del mismo grupo en la misma orientación.
3. Pon un poco de parafina en un molde.
4. Recoger todos los hemi-calvarias con los fórceps y colocarlos dentro del molde con la sutura sagital hacia la base del molde.
   NOTA: La orientación de los hemi-calvarias en el molde durante la inclusión es crucial para obtener secciones histológicas consistentes y resultados reproducibles porque esta orientación permitirá la identificación posterior de los huesos frontales y parietales de las calvarias y la sutura coronal facilitando la evaluación cuantitativa.
5. Suelte los fórceps y verifique que los hemi-calvarias permanezcan en su lugar.
6. Coloque el cassette etiquetado en la parte superior del molde y llénelo con más parafina para cubrir los hemi-calvarias.
7. Mueva los moldes a la superficie fría.

8. Seccionamiento

1. Recortar 500-600 m de la sutura sagital con el microtome.
2. Corta secciones de 4 m de espesor y recoge las secciones necesarias.
3. Recortar otros 300 m.
4. Cortar y recoger otras seis secciones de 4 m de espesor.
5. Recorta aún más el bloque 300 m y recoge más secciones.
6. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio.
7. Seque los portaobjetos en RT.

9. Tinción

1. Sumerja las secciones en 100% xileno durante 3 min.
2. Sumergir en etanol 100% durante 1 min.
3. Combinar en etanol 96% durante 1 min.
4. Sumergir en 80% etanol durante 1 min.
5. Sumergir en 70% etanol durante 1 min.
6. Enjuagar en agua durante 3 min.
7. Sumergir en hematoxilina durante 3 min.
8. Enjuagar en agua hasta que la sección esté clara.
9. Sumergir en una solución saturada de carbonato de litio durante 10 s.
10. Enjuagar en agua durante 3 min.
11. Sumergir en etanol 96% durante 1 min.
12. Sumergir en eosina durante 3 min.
13. Sumergir en etanol al 96% durante 1 min.
14. Sumergir en etanol 100% durante 1 min.
15. Sumergir en 100% xileno durante 3 min.
16. Agregue un poco por medio de montaje a la corredera y protéjala con un cubreobjetos.
    NOTA: Puede complementar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) con la tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) para evaluar la osteoclasto y la osteolisis.

10. Evaluación cuantitativa: área de definición para el análisis

1. Examine las secciones bajo baja potencia (es decir, 4x) para identificar la orientación y las suturas.
2. Defina la sutura coronal e identifique la superficie ósea larga en un lado y la superficie corta en el otro.
3. Identifique la sutura coronal bajo un aumento de 40x y mueva dos o tres campos ópticos lejos de la sutura a lo largo de la superficie larga. Capture imágenes de esta área para su análisis.
4. Defina el área ósea antigua y la nueva área ósea. La eosina Y con G naranja mancha el hueso viejo más oscuro y el nuevo hueso más claro.
5. Mida el área ósea total del hueso antiguo y nuevo con el software Image J utilizando la herramienta de umbral de color. Expresar los resultados como 2^.

11. Análisis de datos

1. Analice los resultados utilizando software estadístico. Se pueden determinar diferencias significativas entre grupos mediante pruebas apropiadas (por ejemplo, prueba no paramétrica Mann-Whitney U como se hace el tacón).

Results

Para evaluar la formación ósea en el modelo calvarial, cultivamos las hemi-calvarias en medios con o sin 50 g/ml de insulina. Las secciones de tejido se prepararon y teñiron con H&E. En estas condiciones, la histología demostró que se mantenía la integridad estructural del hueso calvarial, permitiendo la identificación de sus diferentes componentes(Figura 1). Las calvarias tratadas con insulina presentaron un aumento en la cantidad de tejido óseo en compa...

Discussion

Aquí, describimos el protocolo para un modelo calvarial ex vivo para evaluar la formación o resorción ósea y para estudiar las interacciones de las células cancerosas con el hueso del ratón calvarial. Los pasos críticos de esta técnica son la disección, el cultivo, la incrustación y el análisis histomorfométrico de las calvarias. Durante la disección de las calvarias, es crucial cortar el hemi-calvarias en un trapezoide, ya que facilitará fuertemente la orientación durante la inclusión de la parafina. Al estudia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cultivo celular de 24 pocillos	Corning	CLS3524
24 pocillos sin cultivo de tejidos	Falcon	15705-060
2 mL criovial	SSI	2341-S0S
	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrífuga	Eppendorf 22628188		centrífuga 5810R
Cubreobjetos	Corning	2935-24X50
Resina Cytoseal	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina, sin piruvato de sodio	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Casetes de Ebedding	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Estación de trabajo de incrustación	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Etanol absoluto	JALMEK	E5325-17P
Suero fetal bovino	Biowest BIO-S1650-500
Filtros	Corning	CLS431229
Pinzas y tijeras	LANCETA HG	74165
Formol tamponado 10%	Sigma	HT501320
Portaobjetos de vidrio 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
perfil alto	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulina de páncreas bovino	Microscopio Sigma	16634
	Microtomo ZEISS	Axio Scope.A1
Microtomo	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Alimento para ratones, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Naranja G	Biobasic	OB0674-25G
Parafina	Paraplast	39601006
Baño de flotación de sección de parafina	MH8517X1		electrotermal
	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Azul	de tripánSigma	T8154
Tripsina-EDTA	Corning	25-051-CI
cera	Electrotermal MH8523BX1
Xileno	Dorado	534056-500ML