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Artículo de método

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

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DOI:

10.3791/59034

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27 de febrero de 2019

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En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Resumen

Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.

Introducción

En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1....

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Protocolo

1. síntesis del Acids–Platinum(II) ácido oleico conjugado

  1. Activación de cisplatino
    1. Suspender (0.167 mmol) de 50 mg de cisplatino, en 4 mL de agua (por ejemplo, nanopure) a 60 ° C.
    2. Añadir gota a gota 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 en 0,5 mL de agua a la solución de cisplatino y revuelva la reacción durante al menos 2 h a 60 ° C. El precipitado blanco de AgCl forma indicando el progreso de la reacción.
    3. Para determinar si la reacción de activación se ha completado, realice la prueba con 10% ácido clorhídrico la presencia de iones de Ag+ libre en solución. La prueba debe ser negativa (no debe formar más precipit....

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Resultados

Imagen de TEM representante de KYF-Pt-NE preparado mediante este protocolo se muestra en la figura 2A. KYF-Pt-NEs son esféricos en morfología, bien dispersa y uniforme en tamaño. El diámetro del núcleo de KYF-Pt-NEs, medido directamente en tres imágenes TEM con un mínimo de 200 medidas hecho, es 107 ± 27 nm. Diámetro hidrodinámico de KYF-Pt-NE, analizada mediante espectroscopia de luz dinámica (DLS), fue encontrado para ser 240 nm con un índice de polidispers.......

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Discusión

Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condiciones sintético.......

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Divulgaciones

Autores no tienen un conflicto de interés que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
tetrafluoroborato (TBTU)
ANASPEC INC.:AS-20376SPPS
Plato confocal de 4 pocillosLab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526Para la obtención de imágenes
ácido 6-bromohexanoicoChem-Impex INT' L INC.24477Modificación de clic para el péptido
A2780Generosamente realizado por el profesor John Martignetti del HospitalLínea celular de cáncer de ovario
BarnsteadNanopure Thermo FisherD11901sistema de filtración de agua
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090Para la eliminación de disolventes y el secado de muestras
Centrífuga 5810 Reppendorf5811FPara la separación de complejos de platino
Cis-diclorodiaminaplatino (II) 99%Acros Organics19376-0050pruebas in vitro
CP70Generosamente diseñado por el profesor John Martignetti del Hospitalcáncer de ovario
Baño de agua digitalVWR97025-134Para calentar medios para cultivos celulares
Dispersión dinámica de la luz (DLS)Brookhaven Instrument CorporationPara mediciones de tamaño de nanopartículas
ES-2ATCCCRL-1978línea celular de cáncer de ovario
Fmoc-L-Lys (Boc)-OH 99.79%Chem-Impex INT' L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe Resina de alcohol 4-alcoxibencílico (0,382 meq/g),Chem-Impex INT' L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
Incubadora de CO2 HERACELL 150iIncubadora Thermo Scientific Fisher
Bomba de jeringa de alta presiónNew Era1010-USPara la adición de complejos de platino en la síntesis de nanopartículas
Placa calefactora/agitadorVWR12365-382Para la agitación y el calentamiento
de muestrasAnticuerpo LAMP-1 (cojugado con Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647Para imágenes
de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)Oakwood Chemical 005027SPPS
Ninhidrina 99%Alfa AesarA10409Prueba Kaiser
Ácido oleicoChem-Impex INT' L INC.01421Para la síntesis de complejo de platino
OV90ATCCCRL-11732Línea celular de cáncer de ovario
PBSCorning21-031-CVPara lavado de células
Medio de montaje PermountFisher ChemicalSP15-100Para la obtención de imágenes
FenolFisher ChemicalA92500Prueba Kaiser
Ácido fosfotúngstico FisherChemicalA248-25tinción negativa para TEM
Piperidina 99%BTC219260-2.5L
SPPS Platino AAS estándar soultionAlfa Aesar880861000ug/ml para curva de calibración
Bromuro de propargilo 97%Alfa AesarL10595Para la modificación alquina de la fluoresceína
Gabinete biológico científicoThermo Scientific Fisher1385Bio-hood para cultivo celular
Sistema de vacío autolimpianteWelch2028Bomba de vacío para rotavapor
Nitratode plata Acros Organics19768-0250Activación de cisplatino
SKOV3ATCCHTB-77Línea celular de cáncer de ovario
Hidróxido de sodioFisher ScientificS313-1Para la síntesis del complejo de platino
Cloruro deestaño (II)Sigma Aldrich208256Prueba de presencia de platino
TOV21GATCCCRL-11730Línea celular de cáncer de ovario
Ácido trifluoroacético 99% (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triisopropilsilano (TIPS)Chem-Impex INT' L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLPara la obtención de imágenes
Polvo de uranina 40%Fisher Scientific S25328APara la modificación de alquinos de la fluoresceína
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartorioVS2001Para el lavado y la condensación de nanopartículas
Microscopio invertido VWRVWR89404-462Para la monitorización de cultivos celulares
del Mount Sinai Mount Sinai Línea celular de

Referencias

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....

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