Monitoreo de la supervivencia Neuronal a través de microscopía de fluorescencia Longitudinal

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de seguimiento de sobrevivencia de forma unicelular e identificar variables que predicen significativamente la muerte celular.

Resumen

Ensayos de citotoxicidad estándar, que requieren la colección de lisados o células fijas en varios puntos del tiempo, han limitado la sensibilidad y la capacidad para evaluar los factores que influyen en la suerte neuronal. Estos ensayos requieren la observación de diferentes poblaciones de células en los puntos de tiempo discretos. Como resultado, las células individuales no pueden seguirse prospectivamente con el tiempo, limitando seriamente la capacidad de discriminar si eventos subcelulares, tales como formación de puncta o mislocalization proteína, son patogénicos de enfermedad, respuestas homeostáticas, o fenómenos meramente coincidentes. Sola célula longitudinal microscopia supera estas limitaciones, permitiendo al investigador determinar las diferencias en la supervivencia entre las poblaciones y las relaciones causales con mayor sensibilidad. Esta video guía describirá un flujo de trabajo representativa para los experimentos de medición unicelular supervivencia de neuronas corticales primarias de rata expresan un marcador de proteína fluorescente. El visor se aprende a lograr alta eficiencia transfecciones, recoger y procesar imágenes permitiendo el seguimiento prospectivo de células individuales y comparar la supervivencia relativa de poblaciones neuronales utilizando el análisis de riesgos proporcionales de Cox.

Introducción

Muerte celular anormal es un factor de conducción en muchas enfermedades, incluyendo cáncer, neurodegeneración y tiempos¹. Robustos y sensibles análisis de muerte celular son esenciales para la caracterización de estos trastornos, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas para ampliar o reducir la supervivencia celular. Actualmente existen decenas de técnicas para la medición de muerte celular, ya sea directamente o a través de sustituto marcadores². Por ejemplo, la muerte celular puede ser evaluada visualmente con la ayuda de colorantes vitales que tiñe selectivamente las células muertas o vivas³, o mediante el control de la aparición de fosfolípidos específicos en la membrana plasmática^4,5,6 . Mediciones de componentes intracelulares o metabolitos celulares liberados en los medios de comunicación sobre disolución celular también pueden ser utilizadas como sustitutos célula muerte^7,8. Por otra parte, viabilidad celular se puede aproximar mediante la evaluación de la actividad metabólica^9,10. Aunque estos métodos proporcionan medios rápidos de evaluar la supervivencia de la célula, no son sin salvedades. Cada técnica observa la cultura como una sola población, haciendo imposible distinguir entre las células individuales y su ritmo único de supervivencia. Además, estos ensayos poblacionales son incapaces de medir factores que pueden ser importantes para la muerte celular, incluyendo localización, morfología celular y expresión de la proteína. En muchos casos, estos ensayos están limitados a puntos de tiempo discretos y no permiten la observación continua de las células con el tiempo.

En cambio, la microscopía de fluorescencia longitudinal es una metodología altamente flexible que directamente y continuamente monitorea el riesgo de muerte en una sola célula base¹¹. En Resumen, microscopía de fluorescencia longitudinal permite miles de células individuales para realizar un seguimiento a intervalos regulares durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite determinaciones precisas de la muerte de las células y los factores que mejoran o inhiben la muerte celular. En su base, el método implica la transfección transitoria o transducción de células con vectores que codifican las proteínas fluorescentes. Luego se establece un único Fiduciario, y la posición de cada célula transfected en relación con este monumento permite al usuario de la imagen y seguir las células individuales en el transcurso de horas, días o semanas. Cuando estas imágenes se ven secuencialmente, la muerte celular se caracteriza por cambios característicos en la fluorescencia, la morfología y la fragmentación del cuerpo de la célula, permitiendo la asignación de un tiempo de la muerte para cada celda. La tasa calculada de la muerte, determinada por la función de riesgo, puede entonces ser cuantitativamente en comparación entre condiciones, o relacionados con seleccionar características celulares usando univariantes o multivariantes de análisis de riesgos proporcionales Cox¹². Juntos, estos métodos permiten la discriminación precisa y objetiva de las tasas de muerte celular en poblaciones celulares y la identificación de las variables que predicen significativamente la muerte celular o supervivencia (figura 1).

Aunque este método puede utilizarse para monitorear la supervivencia en cualquier tipo de poste-mitotic de la célula en una variedad de formatos de la galjanoplastia, este protocolo describe las condiciones de transferencia y proyección de imagen las neuronas corticales de rata cultivadas en una placa de 96 pocillos.

Protocolo

Animal vertebrado todo el trabajo fue aprobado por el Comité sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos se planean cuidadosamente para reducir al mínimo el número de animales sacrificados. Embarazadas mujer tipo salvaje (WT), ratas de largo Evans no transgénicas (Rattus norvegicus) se encuentran solo en cámaras equipadas con enriquecimiento ambiental y atendida por la unidad de medicina Animal laboratorio (ULAM) en la Universidad de Michigan, en acuerdo con la guía de apoyo de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todas las ratas se mantuvieron en la vivienda como poca hora como sea posible antes de la eutanasia, consistente con las recomendaciones de las directrices sobre la eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria americana y la Universidad de Michigan métodos de eutanasia por rutina Guía de especies.

1. material preparación

1. Diseccionar las neuronas corticales de embrionario día que 19 – 20 cachorros de rata y cultura rata neuronas corticales en 0.5 x 10⁶ células por mililitro en placas cubiertas poly-D-lisina para 4 días en vitro, tal como se describe anteriormente^{13,14, 15,16,17,18,19}.
2. Preparar el plásmido de DNA de interés siguiendo los pasos descritos por un aislamiento de DNA de plásmido libre de endotoxina kit (véase Tabla de materiales). Cuantificar el ADN resultante usando un espectrofotómetro.
3. In vitro día 4 (DIV4), alícuota, filtro esterilizar, incubar a 37 ° C: 6 mL los siguientes medios de reducir medios suero (RSM, por ejemplo., OptiMEM), 25 mL neuronal basal media (NBM), 40 mL NBKY (Banco Nacional de Moldova + ácido quinurénico de 1 mM + 10 mM MgCl₂, ajustada a un pH de 7. 4), 10 mL NBC (NBM 1 x neuronal celular suplemento Cultura + 1 x suplemento de L-glutamina + 1 x pluma Strep).
   Nota: Volúmenes mencionados son suficientes para la transferencia de una placa de 96 pocillos. Consulte la Tabla de materiales reactivos específicos.

2. transfección de las neuronas corticales de rata

1. Modificar la proporcionado hoja de transfección de ejemplo (ver 1 archivo suplementario) ajustando el tipo de placa, mapa de placa, número de DNAs, concentración de ADN y el número de pozos (caja verde).
   Nota: El ADN total suma 0.2 μg por pozo, independientemente de si uno (por ejemplo,., A ADN) o múltiples (e.g., DNA B y C) construcciones de ADN se añaden a cada pocillo.
2. Trabajo de la hoja de cálculo, combinar la cantidad adecuada de RSM y de ADN en un tubo. Combinar la cantidad adecuada de RSM y transfección reactivos (por ejemplo, Lipofectamine) en un tubo separado.
3. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos.
4. Combinar el ADN y transfección reactivos RSM de mezclas e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Durante esta etapa de incubación, utilice una pipeta multicanal y bebederos de plástico estériles para lavar las células x 2 con 100 μl por pocillo de NBM. Reserva los medios condicionados (CM) y almacena a 37 ° C. Por esto y siguiendo los pasos, tenga cuidado para reducir al mínimo la cantidad de tiempo que las neuronas están expuestas al aire.
6. Quitar los medios de comunicación NBM y reemplazar con 100 μl por pozo de NBKY.
7. Después de 20 min, agregar 50 μl de la mezcla de ADN reactivo de transfección gota a gota a cada pocillo.
8. Incubar las células con los complejos de ADN reactivo de transfección por 20 min a 37 ° C.
9. Enjuague 2 x con NBKY y reemplace con 100 μl de CM y 100 μl de NBC por pozo.
10. Con éxito transfected las células deben ser visibles por microscopía de fluorescencia dentro de 16 a 24 h de la transfección. Para medir eficiencia, usar un microscopio de fluorescencia para comprobar la transfección después de la incubación durante la noche a 37 ° C.
    Nota: Esta técnica da como resultado una total eficacia de transfección del 5 al 10%.

3. la proyección de imagen

1. Coloque la placa en un microscopio de fluorescencia con una etapa motorizada y establecer un Fiduciario (por ejemplo, una marca en la parte inferior de la placa) que permitirá al usuario alinear la placa cada vez que es reflejada. Guardar una imagen de este Fiduciario para referencia.
2. Desplácese a un campo de interés y tenga en cuenta las coordenadas x-y en relación con el Fiduciario.
3. Se centran en las células transfected con una etiqueta fluorescente.
4. Tomar imágenes fluorescentes en el canal o canales (p. ej., proteína fluorescente de la proteína fluorescente roja [convocatoria], verde [GFP], 4′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), ya sea manualmente o de forma automatizada. Tomando varias imágenes a intervalos regularmente espaciados, un montaje del pozo puede ser montado durante el procesamiento de imágenes (ver paso 4).
   Nota: El espacio depende de varios factores, incluyendo la ampliación, la óptica del microscopio y el tamaño del detector. En general, la distancia óptica entre imágenes adyacentes será entre 90 – 95% del tamaño de cada imagen individual, para permitir un pequeño grado de superposición de imagen y cuentan con la alineación.
5. Repetir este proceso tantas veces como sea necesario, alineando para el Fiduciario original cada vez. Para el análisis de supervivencia, proyección de imagen ocurre cada 6 – 24 h, dependiendo del tipo de célula y el propósito del experimento.

4. tratamiento de la imagen

Nota: Adquisición de la imagen, una serie de pasos de procesamiento se requiere antes de análisis de imagen. Éstos incluyen, pero no se limitan a, costura, apilado y sustracción de fondo (figura 1). El objetivo de estos pasos es producir una imagen pila o serie de tiempo, en el que las células son claramente discernibles desde sus antecedentes y fáciles de seguir sobre varios puntos del tiempo. Un macro dedicado de FIJI (Image_Processing.ijm, ver 2 archivos suplementarios), realiza costura básica, apilado y resta del fondo. Se presenta una explicación de cada paso y los parámetros a tener en cuenta al realizar procesamiento de imágenes en la sección de discusión.

1. Ajustar los datos crudos o directorio de entrada para que coincida con el formato mostrado en la figura 2.
2. Si los momentos no son contiguos (es decir, T1, T2, T3), cambiar el nombre de estas carpetas para que sean. Este paso es vital para que la macro Image_Processing chocar durante el apilado.
3. Haga doble clic en el icono de Fiji para abrir el programa, a continuación, haga clic y arrastre la macro Image_Processing en la barra de Fiji. Esto abrirá la macro en Fiji.
4. Ajustar líneas 2-7 de la macro Image_Processing para especificar el directorio de entrada que contiene imágenes, el directorio de salida deseado para cosido y apilados de imágenes, el número de puntos de imagen tiempo, número de canales fluorescentes y formato de placa.
5. Determinar el orden en que fueron adquiridas las imágenes. Para probar esto, coser manualmente un montaje de imágenes en FIJI por maniobrar a lo Plugins desplegable menú | La costura | Rejilla/colección costura. Ajuste la configuración en el menú desplegable tipo y orden hasta que se produce una imagen exactamente cosida.
6. Ajustar las variables GRID_TYPE y STITCH_ORDER en las líneas 8 y 9 de la macro Image_Processing para que coincida con estas selecciones.
7. Especificar el número de imágenes por bien ajustando la línea 10 en la macro Image_Processing .
   Nota: Para un montaje de 2 x 2 de imágenes, esta línea quedaría DIM = 2.
8. Si el fondo es necesario, ajustar la línea 14 en la macro Image_Processing a BGSUB = true.
9. Establece el radio de la bola rodante ajustando la línea 15 en la macro Image_Processing .
   Nota: Para obtener resultados óptimos, establezca el radio en por lo menos el diámetro del objeto más grande de primer plano en la imagen.
10. Haga clic en Ejecutar para iniciar la macro Image_Processing . Una vez iniciado, Image_Processing avanzará automáticamente a través de la costura, apilado y fondo.

5. anotar la muerte celular

Nota: Consulte la sección de discusión para obtener más información sobre puntuación muerte celular y datos de censura.

1. Ubicar las pilas de la imagen producidas por la secuencia de comandos Image_Processing . Abrir estos en FIJI.
2. Utilice la herramienta del punto dentro de FIJI para etiquetar individualmente cada célula con un número. Presionando t después de cada punto agrega el identificador de la célula a cargo ROI (región de interés).
   Nota: Los identificadores se pueden visualizar haciendo clic en las casillas de las etiquetas y Mostrar todo en el ROI Manager.
3. Progreso a través de los puntos de tiempo en cada pila de imagen y grabar el punto cuando cada célula muere o necesita ser censurado en el archivo Survival_spreadsheet.csv (ver archivo suplementario 3).
   1. Cada celda ocupa una sola fila en la hoja de cálculo, donde un identificador único (ID) para cada celda consiste en su correspondiente bien y número de retorno de la inversión dentro de ese pozo. tp_death es el último punto de tiempo que se observa una célula a estar vivos, mientras que time_death representa el tiempo real de la muerte en horas. Para cada celda, estos datos de entrada. Es fundamental para mantener esta estructura para el análisis posterior con supervivencia. R (ver 4 archivos suplementarios).
      Nota: Los criterios para determinar la muerte de la célula son cruciales y pueden variar dependiendo del tipo de la célula. Tres criterios principales se utilizan en la identificación de las neuronas muertas^11,20 (figura 3): pérdida de intensidad de fluorescencia (p. ej., 1 neurona en 69 h), redondeo del cuerpo de la célula (por ejemplo, la neurona 2 188 h) y la pérdida de neurita integridad o blebbing (por ejemplo, la neurona 2 188 h).
4. Registrar el estado del censor de la célula en la última columna.
   Nota: Aquí, debido a la peculiar forma de censura es manejada por R, células censuradas son marcadas por 0, mientras que las células sin censura están marcadas con 1. Tenga en cuenta que todas las células que viven hasta el último momento son censuradas y por lo tanto marcadas como 0.

6. realizar proporcional de Cox de riesgos análisis y visualización de resultados

1. Si es necesario, descargar R studio en https://cran.r-project.org/mirrors.html.
2. Abrir R studio y haga doble clic en el icono para la supervivencia de la . R secuencia de comandos.
3. Coloque el cursor en la línea 2 de supervivencia . R y haga clic en el botón Ejecutar en la ventana principal de studio R para cargar la biblioteca de supervivencia.
4. Cambiar la línea 5 de la supervivencia . R secuencia de comandos para que coincida con la ubicación del archivo Survival_spreadsheet.csv. Haga clic en Ejecutar para cargar los datos de supervivencia como una dataframe.
5. Líneas 8 y 9 de resalte y haga clic en el botón Ejecutar en la ventana de la consola de R studio para realizar análisis de riesgos proporcionales de Cox. Resultados y estadísticas de salida aparecen en la ventana de la consola de R studio.
6. Destacan líneas 12-16 de de supervivencia. R y presione el botón Ejecutar para producir un riesgo acumulado de trama de la muerte, que aparece en la ficha de parcelas en el estudio de R. Este archivo se puede guardar haciendo clic en el botón exportar por encima de la trama.
7. Si es deseable para trazar los datos de supervivencia como una curva de Kaplan-Meier, destacan las líneas 19-24 de de supervivencia. R y presione el botón Ejecutar .

Resultados

Utilizando el procedimiento de transfección descrito aquí, DIV4 neuronas corticales de rata fueron transfectadas con un plásmido de codificación de la proteína fluorescente mApple. A partir de transfección después de 24 h, las células fueron reflejadas por microscopía de fluorescencia cada 24 h por 10 días consecutivos. Las imágenes resultantes fueron organizadas como se indica en la figura 2, luego cosidas apiladas y anotó para la muerte celular (

Discusión

Aquí, se presenta la metodología para monitorear directamente la supervivencia neuronal en forma unicelular. En contraste con los ensayos tradicionales de muerte celular que se limitan a puntos de tiempo discretos y poblaciones enteras de las células, este método permite la evaluación continua de una variedad de factores como la morfología celular, expresión de la proteína o localización, y puede determinar cómo cada factor influye en la supervivencia celular en forma prospectiva.

Esta metodol...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Neurobasal	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plásmido Maxi Kit	Qiagen	12863
Cloruro de magnesio Hexahidrato Sigma		M9272
Hidrato de ácido quinurénico	TCI	H0303
Poly D-Lisina	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 suplemento	Thermo Fisher	A3582801
Penicilina/Estreptomicina	GIBCO	15140122
placas de 96 pocillos	TPP	0876