Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Resumen

Las proteínas son los principales operadores de los sistemas biológicos, y generalmente interactúan con otros macro o pequeñas moléculas para llevar a cabo sus funciones biológicas. Estas interacciones pueden ser altamente dinámicas, lo que significa las subunidades interactúan constantemente asociadas y disociadas en determinados tipos. Medir la afinidad usando técnicas tales como desplegable cuantitativa revela la fuerza de la interacción, estudiando la cinética de Unión proporciona penetraciones en cómo rápidamente se produce la interacción y cuánto tiempo puede existir cada complejo. Además, medir la cinética de la interacción en presencia de un factor adicional, como un factor de intercambio de proteínas o una droga, ayuda a revelar el mecanismo por el cual la interacción está regulada por el factor conocimiento importante para la avance de la investigación biológica y médica. Aquí, describimos un protocolo para la medición de la cinética de unión de una proteína compleja que tiene una tasa alta asociación intrínseca y puede disociarse rápidamente por otra proteína. El método utiliza la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia para divulgar la formación del complejo de la proteína in vitro, y permite la rápida asociación y disociación del complejo en tiempo real en un Fluorímetro de flujo detenido. Usando este análisis, se cuantifican las constantes de tarifa de asociación y disociación de la proteína del complejo.

Introducción

En última instancia se llevan a cabo actividades biológicas de proteínas, más que interactuar con otros para las funciones biológicas apropiadas. Usando un enfoque computacional, el importe total de las interacciones proteína-proteína en humanos se estima que 650.000 ~¹, y la interrupción de estas interacciones a menudo conduce a enfermedades². Debido a su papel esencial en el control de procesos celulares y organismos, se han desarrollado numerosos métodos para estudiar interacciones de proteínas, tales como levadura dos-híbrido, complementación bimolecular de la fluorescencia, split-luciferase complementación y co-inmu....

Protocolo

1. diseño del ensayo de traste.

1. Descargar el archivo de estructura de la Cul1•Cand1 complejo de Protein Data Bank (archivo 1U6G).
2. Ver la estructura de la Cul1•Cand1 complejo en PyMOL.
3. Utilice la función de medición bajo el menú Asistente de PyMOL para estimar la distancia entre el primer aminoácido de Cand1 y el último aminoácido de Cul1 (figura 1).
4. El visor de espectros en línea de carga (véase Tabla de materiales) y los espectros de emisión de 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) y FlAsH y excitación al mismo tiempo (figura 2

Resultados

Para probar el traste entre Cul1^AMC y Cand1 ^FlAsH, primero determinamos la intensidad de emisión de 70 nM Cul1^AMC (el donante) y 70 nM Cand1 ^FlAsH(el aceptador), respectivamente (Figura 3A-C, azul líneas). En cada análisis, solamente un pico de emisión era presente y la emisión de Cand1 ^FlAsH(el aceptador) fue bajo. Cuando 70 nM de Cul1^AMC y ^destelloCand1 se mezclaro.......

Discusión

TRASTE es un fenómeno físico que es de gran interés para el estudio y comprensión de los sistemas biológicos¹⁹. Aquí, presentamos un protocolo para probar y usar trastes para estudiar la cinética de unión de dos proteínas interactuantes. Al diseñar el traste, se consideraron tres factores principales: el solapamiento espectral entre donantes emisión y aceptador de la excitación, la distancia entre los dos fluoróforos y la orientación del dipolo de los fluoróforos²⁸. Para el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Columna de cromatografía de intercambio aniónico	GE Healthcare	17505301	HiTrap Q FF columna de cromatografía de intercambio aniónico
Centrífuga refrigerada de sobremesa	Eppendorf	2231000511
BL21 (DE3) Células competentes	ThermoFisher Scientific	C600003 Cloruro
de calcio	Fisher Scientific	C78-500
Intercambio catiónico columna de cromatografía	GE Healthcare	17505401	HiTrap SP Sepharose FF
Columna de desalinización	GE Healthcare	17085101
Centrífuga de suelo (alta velocidad)	Beckman Coulter	J2-MC
Centrífuga de suelo (baja velocidad)	Beckman Coulter	J6-MI
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
Fluorímetro FluoroMax	HORIBA	FluoroMax-3
FPLC	GE Healthcare	29018224
GGGGAMC	péptido New England Peptide	síntesis personalizada
Perlas de glutatión	GE Healthcare
Glicerol	Fisher Scientific	G33-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-100
Isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG)	Fisher Scientific	15-529-019
LB Caldo	Fisher Scientific	BP1426-500
Ni-NTA agarosa	Qiagen	30210
Ovoalbúmina	MilliporeSigma	A2512
pGEX-4T-2 vector	GE Healthcare	28954550
Cóctel de inhibidores de la proteasa	MilliporeSigma	4693132001
glutatión reducido	Fisher Scientific	BP25211
Agitador refrigerado	Eppendorf	M1282-0004
Rosetta Células competentes	MilliporeSigma	70953-3
Columna de cromatografía de exclusión por tamaño	GE Healthcare	28990944	Superdex 200 10/300 GL
columna Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Fluorímetro de flujo detenido	Hi-Tech Scientific	SF-61 DX2
TCEP· HCl	Fisher Scientific	PI20490
Trombina	MilliporeSigma	T4648
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Membrana de ultrafiltración	MilliporeSigma	UFC903008	Amicon Ultra-15 Unidades de filtro centrífugo, Ultra-15, 30.000 NMWL