Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Summary

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Abstract

Movilidad de la célula de cáncer es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación de movimiento celular y capacidad invasiva es de gran importancia. Ensayos de migración proporcionan información básica del movimiento de la célula en un nivel 2D, mientras que los ensayos de invasión son más fisiológicamente relevantes, imitando el desplazamiento de la célula de cáncer en vivo desde el sitio original e invadiendo a través de la matriz extracelular. El protocolo actual proporciona un único flujo de trabajo para los ensayos de migración y la invasión. Junto con la cámara microscópica automatizada integrada para el módulo de análisis integrado y en tiempo real imágenes de alta definición, da a investigadores un tiempo eficiente, simple y reproducible opción experimental. Este protocolo también incluye sustituciones para los consumibles y los métodos de análisis alternativos para los usuarios elegir.

Introduction

Migración celular y la invasión son procesos biológicos importantes que permiten las funciones normales del cuerpo humano, como el cierre de la herida, invasión de la placenta en el útero y glándula mamaria morfogénesis^1,2,3. El cuerpo humano tiene el control preciso y estricto de estos acontecimientos biológicos; sin embargo, hay algunas excepciones. Tumores malignos, por ejemplo, son capaces de escapar de esta salvaguardia, exhibir proliferación anormal e invadir el tejido vecino, que se llama metástasis. La metástasis es la causa principal de mortalidad relacionada con cáncer⁴.

Cáncer de mama es el más comúnmente diagnosticado cáncer en la mujer y es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer entre las mujeres en los países desarrollados en todo el mundo⁵. El cáncer de mama se origina de los conductos o lobulillos que constan de una o más capas de células epiteliales. En la mama normal, las células epiteliales se adhieren unos a otros y a la membrana basal a través de proteínas de membrana como la E-cadherina e integrinas⁶. Sin embargo, las células de cáncer de mama invasivo han perdido su polaridad y la adherencia de la célula, clásico experimentan la transición epitelial mesenquimal (EMT) y obtienen la capacidad de moverse. Después de la extravasación, estas células mover a través de la matriz extracelular (ECM) y entrar en los vasos sanguíneos o el sistema linfático, seguido luego por intravasación y crecimiento metastásico⁷. Comprensión de los mecanismos por los cuales esto se produce es de gran importancia, puesto que la metástasis es la causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer y está estrechamente relacionado con el cáncer migración/invasión de la célula. Para visualizar el movimiento de las células cancerosas, ensayos de migración y la invasión son modelos ideales para el estudio de movimiento de la célula 2D y 3D, respectivamente. Migración evalúa directamente el movimiento de las células mientras que la invasión implica la interacción con el microambiente y la capacidad para degradar barreras biológicas. Los dos procesos no son totalmente independientes uno del otro, como la migración es un requisito de la invasión.

Varios métodos se han desarrollado para estudiar la migración y la invasión. Como revisado por Kramer et al., ensayos de migración como la cicatrización de heridas, análisis de micro-portador y cerca de generan un área libre para permitir a las células para que mover, evaluar el cambio de área; mientras que los análisis transwell y capilar se basan en el número de células que se mueven hacia un atrayente⁸. Para los ensayos de invasión, un ambiente de ECM tiene que configurarse con gel de ECM o colágeno por ejemplo, y movimiento 3D puede evaluarse mediante el control de las cuentas de área, distancia y celular de la invasión (e.g. transwell ensayo, ensayo de platypus)⁸. Otro tipo de ensayo de invasión es combinar las células invasoras con células no-invasivo y evaluar el comportamiento de las células invasoras (e.g. ensayos de esferoide). Los métodos tienen sus pros y contras y una manera fácil de enfoque, fácil de repetir y combinar el análisis de la migración y la invasión en un flujo de trabajo similar es preferencial en diseño experimental.

Este protocolo describe la medición de la migración celular y la invasión utilizando un reproductor de imágenes de células vivas. Es un celular en tiempo real sistema instalado en una incubadora de cultivo de célula estándar de monitoreo. Toma imágenes de alta definición según el sistema de análisis de intervalos y mediciones aplicando máscaras apropiadas a las células o fluorescentes blancos. El módulo de análisis de migración/invasión incluye el uso de una herramienta scratch de 96 pines, que es conveniente para hacer heridas de rasguño homogéneas en una monocapa de células en una placa de 96 pocillos. El mecanismo se basa en in vitro herida curación ensayos, control de movimiento celular 2D en un plástico o superficie cubierta. Invasión o movimiento 3D a través de un ECM adicional dentro de la raya de la herida también puede ser evaluada. Un breve flujo de trabajo se ilustra en la figura 1.

Protocol

Nota: Dos líneas celulares deben tratarse por separado. Los siguientes procedimientos deben aplicados a una línea de celular solo si no se especifica.

1. optimizar la densidad de la célula antes de la herida

1. Las células adherentes en frascos de cultivo de tejidos T75 cm² a cerca de 80% de la cultura confluencia en de rojo de fenol libre Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 200 mM L-glutamina y 2 insulina μg/mL a 37 ° C con 5% CO₂ ( las condiciones de incubación estándar para más líneas celulares de cáncer, formulaciones de cultura son celular dependiente de la línea).
2. Quitar los medios de cultivo mediante pipeteo apagado en un contenedor de residuos. Pipeta 2 mL de precalentado 0.1% tripsina-EDTA a brevemente enjuague la monocapa celular y pipeta. Agregar otro 2 mL de tripsina-EDTA 0.1% y coloque el matraz bajo condiciones estándar de incubación a 37 ° C durante 5 minutos.
3. Golpee suavemente el frasco para asegurar la separación de las células y luego añadir 10 mL con medio de cultivo para detener la reacción proteolítica.
4. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 15 mL y un spin abajo a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Cuidadosamente Quite el sobrenadante sin agitar el sedimento celulares y resuspender con otro medio de cultivo con 10 mL.

2. conteo celular mediante un contador de células automatizado (o cualquier método de conteo)

1. Diluir 200 μL de suspensión celular resuspendidos con 800 μl de 1 x fosfato de Dulbecco tampón salino (DPBS) en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
2. Coloque un sensor de conteo celular de 60 μm en el contador celular, mantenga pulsado el botón y la punta se funden en la suspensión de células. Suelte lentamente la palanca hasta que la suspensión de células se dibuja correctamente en el sensor. Concentración de células se muestra en células/mL.
3. Calcular el número de células en la suspensión de células de 10 mL.

3. célula galjanoplastia

1. Células de la placa en el rango de densidades celulares (90.000 de 40.000 células/pocillo) por triplicado en una placa de 96 pocillos.
2. Coloque la placa en el reproductor de imágenes de células vivas y programar la exploración cada 2 h durante 24 h.
   1. En el software, haga clic en programa explora , de la lista de tareas. En el panel de configuración de cajón, determinar la posición de la placa, haga clic en Agregar barco y elegir el tipo de placa. En el panel de Configuración de exploración , elija editar el patrón de exploración según la configuración de la placa experimental y set Tipo Scan como estándar.
   2. Haga clic en la línea de tiempo y seleccione Establecer intervalos. Establezca Añadir escanea cada 2 h en un horario de 24 horas. Haga clic en aplicar.

4. determinar la celda óptima densidad de siembra para el ensayo de migración

1. Stop análisis después de 24 h, aplicar la confluencia proceso herramienta de análisis a las imágenes de contraste de fase HD automáticamente recolectadas y generar una curva de proliferación de la célula contra el tiempo.
   1. Determinar imágenes representativas de 3-6 y colocarlos en una nueva Colección de imágenes.
   2. Determinar una adecuada máscara definición De procesamiento.
   3. Iniciar un trabajo de análisis.
   4. Determinación de densidad optimizada de la célula según confluencia contra el tiempo (aproximadamente 100% de confluencia dentro de 6-18 h dependiendo de Cuándo se inicia el ensayo de migración).
      Nota: La cantidad de tiempo que tardan en crecer las células confluencia varía dependiendo de la dilución sembrada.

5. días 1 y 2: preparación para el análisis de invasión y migración

1. El día 1, recubrir la placa de ensayo de invasión.
   Nota: gel ECM siempre debe ser manejado en el hielo y con consejos que han sido colocados en el refrigerador durante la noche.
   1. Diluir gel de ECM con helada medios de cultivo a 100 μg/mL y agregar 50 μl del diluido ECM gel/medios de comunicación en los pocillos designados.
   2. Coloque el plato en las condiciones de incubación estándar durante la noche.
2. En el día 2, aspirar suavemente el exceso de medio. Células de la placa con densidades optimizada de la célula en 2 placas de 96 pocillos designadas para el ensayo de migración (sin recubrimiento) y el ensayo de invasión (revestido) en triplicado después de las secciones 1-3 en la tarde (en el actual protocolo, densidades de siembra optimizados para ZR75-1 y MDA-MB-231 eran 90.000/así y 50.000/pozo, respectivamente).
3. Coloque las placas en las condiciones de incubación estándar durante la noche.

6. día 3: Herida cero

1. Rocíe y limpie la herramienta scratch y 2 barcos con etanol al 70% se lava antes de colocarlos en la bioseguridad gabinete. Llenar el barco de lavado 1 y 2 con exactamente 45 mL de etanol destilado (esterilizado) estéril de la agua y 70% respectivamente.
2. Para la esterilización, coloque el bloque cero de la herramienta (arriba) sobre el barco 1 y 2 para 5 minutos de lavado.
3. Comience con la placa de ensayo de migración.
   1. Mover la placa que contiene las células de la incubadora y asegúrese de que no bien seco para evitar el daño de la herramienta scratch. Retire la cubierta de la placa e introduzca en el soporte de la placa base de la herramienta scratch y coloque con cuidado la parte superior sobre la pieza base de espigas de guía. Mantenga pulsado la palanca negra y mientras tanto, levante con cuidado el bloque de pin. Vacíos en cada pozo son generalmente visibles a simple vista y al microscopio.
   2. Remojar rápidamente las clavijas en el agua; Esto es suficiente para limpiar la herramienta scratch antes de rayar la placa de ensayo de invasión si configuración de la placa es idéntica. De lo contrario, repita los pasos de esterilización con agua destilada estéril y luego con etanol al 70% durante 5 minutos.
4. Lavado de los tiempos de placa 1 ó 2 con medios de cultivo precalentado para evitar que las células separadas o célula hojas volver al pozo.
5. Añadir 100 μl de medio cálido fresco en los pocillos designados con o sin tratamientos.
6. Pasos adicionales para ensayo de invasión.
   1. Coloque la placa de ensayo de invasión a 4 ° C por 5 min a equilibrar y aspirar cuidadosamente los medios fríos.
   2. Diluir gel de ECM con helada medios de cultivo a 5 mg/mL, añadir 50 μl de gel de ECM diluida en los pocillos designados y bajo estándar incubación durante 30 minutos.
   3. Añadir 100 μl de medio calentado con o sin prueba de compuestos.
7. Coloque la placa de un reproductor de imágenes de células vivas y se deja equilibrar durante 5 minutos seleccionar Tipo de embarcación como placa de imagelock. Set Tipo Scan como Raspar la herida, elegir o editar Patrón de análisis según la configuración de la placa experimental (1 imagen/pozo y modo amplio) y programar 24 h repetir la exploración cada 1-2 h 72 h hasta que las heridas son sanadas.
8. Para limpiar la herramienta scratch, poner el bloque de la parte de arriba en cada una de las siguientes soluciones (45 mL en barcos de lavado) para el detergente de 5 min: 0,5% 1 detergente al 1% (véase Tabla de materiales), 2 (véase Tabla de materiales), etanol de agua y 70% agua destilado estéril. Coloque la herramienta scratch en su placa base y tienda en un ambiente libre de polvo.

7. Análisis de datos

1. Dejar de explorar la placa señalada después de que todas las heridas han sanado eligiendo la placa experimental sobre la Instalación de cajones y haciendo clic en Quitar el recipiente.
2. Recoger 3-6 imágenes representativas que abarcan una gama de porcentajes de sonido, incluyendo derecho de imágenes después de la herida, la herida cierre en 10% y 50%.
3. Para determinar la definición de un adecuado procesamiento, utilice filtros , limpieza y Ajuste de segmentaciónpara aplicar adecuados Scratch herida máscara y Máscara de confluencia. Utilice vista previa corriente, todo para ver la exactitud de las máscaras.
4. Iniciar el trabajo de análisis.
5. Datos pueden ser analizados dentro del software de o exportados para su análisis posterior. Tres indicadores proporcionados por el software pueden utilizarse para evaluar las imágenes HD-fase: confluencia de ancho (μm), herida (%) y densidad relativa de la herida (%) de la herida. Las comparaciones se discutirá en la siguiente sección.

Results

Este análisis de migración/invasión se basan en el análisis de curación de herida, que evalúa la tasa de las células en un área libre creada por la herramienta scratch de 96 pines. La diferencia entre los ensayos de migración y la invasión es que migración ensayos de medida de células en el cultivo de tejidos tratado superficie e invasión medidas células plásticas moviéndose a través del gel de la ECM.

La herramienta scratch est...

Discussion

Migración y la invasión son parámetros importantes para evaluar la movilidad de las células cancerosas. Mediante la herramienta scratch de 96 pines, es posible llevar a cabo la cicatrización análisis en 2D y 3D simultáneamente. Aparte de facilitar la exploración automática, proporcionando un ambiente de cultura de célula estable con mínima interrupción, el rasguño ensayo realizado con la herramienta scratch de 96 pines proporciona constantes heridas rasguños, permitiendo experimentos que son más robustos y reproducible. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de tripsina-EDTA al 0,5% (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Diluir a 2x en DPBS
Contador de celdas automatizado Countess II FL	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Contador de celdas automatizado
Detergente 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0,5% de concentración de trabajo
Detergente 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% de trabajo concentración
Dulbecco' s Águila Modificada Medium, sin rojo fenol	ThermoFisher Scientific	21063-045	Suministrado con 10% FBS, 200 mM L-glutamina, 2 μ g/ml de insulina
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Factor de crecimiento reducido, sin rojo fenol
Essen ImageLock Placa de 96 pocillos, fondo plano	Essen	4379
EVE Portaobjetos de conteo	BioTools	EVS-50
Suero fetal bovino (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-pocillos Invasión celular de la herida por arañazo accesorios	Essen	4444	Incluye CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Kit de migración de células	Essen	4493	Incluye el bloque de pines de 96 pocillos, 2x botes de lavado y el software
IncuCyte ZOOM	Essen		Sistema de análisis de células vivas
Solución de insulina humana	Sigma-Aldrich	19278-5ML
Solución de L-glutamina (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Matraz de cultivo de tejidos, 75 cm2 área de crecimiento	Greiner Bio-One	658175