El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.
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Artículo de método
Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Movilidad de la célula de cáncer es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación de movimiento celular y capacidad invasiva es de gran importancia. Ensayos de migración proporcionan información básica del movimiento de la célula en un nivel 2D, mientras que los ensayos de invasión son más fisiológicamente relevantes, imitando el desplazamiento de la célula de cáncer en vivo desde el sitio original e invadiendo a través de la matriz extracelular. El protocolo actual proporciona un único flujo de trabajo para los ensayos de migración y la invasión. Junto con la cámara microscópica automatizada integrada para el módulo de análisis integrado y en tiempo real imágenes de alta definición, da a investigadores un tiempo eficiente, simple y reproducible opción experimental. Este protocolo también incluye sustituciones para los consumibles y los métodos de análisis alternativos para los usuarios elegir.
Introducción
Migración celular y la invasión son procesos biológicos importantes que permiten las funciones normales del cuerpo humano, como el cierre de la herida, invasión de la placenta en el útero y glándula mamaria morfogénesis1,2,3. El cuerpo humano tiene el control preciso y estricto de estos acontecimientos biológicos; sin embargo, hay algunas excepciones. Tumores malignos, por ejemplo, son capaces de escapar de esta salvaguardia, exhibir proliferación anormal e invadir el tejido vecino, que se llama metástasis. La metástasis es la causa principal de mortalidad relacionada con cán....
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Protocolo
Nota: Dos líneas celulares deben tratarse por separado. Los siguientes procedimientos deben aplicados a una línea de celular solo si no se especifica.
1. optimizar la densidad de la célula antes de la herida
- Las células adherentes en frascos de cultivo de tejidos T75 cm2 a cerca de 80% de la cultura confluencia en de rojo de fenol libre Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 200 mM L-glutamina y 2 insulina μg/mL a 37 ° C con 5% CO2 ( las condiciones de incubación estándar para más líneas celulares de cáncer, formulaciones de cultura son celular ....
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Resultados
Este análisis de migración/invasión se basan en el análisis de curación de herida, que evalúa la tasa de las células en un área libre creada por la herramienta scratch de 96 pines. La diferencia entre los ensayos de migración y la invasión es que migración ensayos de medida de células en el cultivo de tejidos tratado superficie e invasión medidas células plásticas moviéndose a través del gel de la ECM.
La herramienta scratch est.......
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Discusión
Migración y la invasión son parámetros importantes para evaluar la movilidad de las células cancerosas. Mediante la herramienta scratch de 96 pines, es posible llevar a cabo la cicatrización análisis en 2D y 3D simultáneamente. Aparte de facilitar la exploración automática, proporcionando un ambiente de cultura de célula estable con mínima interrupción, el rasguño ensayo realizado con la herramienta scratch de 96 pines proporciona constantes heridas rasguños, permitiendo experimentos que son más robustos y reproducible. .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Fundación del grupo de Bloomfield a través del Instituto de investigación médica Hunter (HMRI 13-02). XZ es apoyado por una beca de la APA a través de la Universidad de Newcastle y la beca de doctorado HCRA biomarcadores insignia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de tripsina-EDTA al 0,5% (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Diluir a 2x en DPBS |
| Contador de celdas automatizado Countess II FL | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Contador de celdas automatizado |
| Detergente 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0,5% de concentración de trabajo |
| Detergente 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% de trabajo concentración | |
| Dulbecco' s Águila Modificada Medium, sin rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Suministrado con 10% FBS, 200 mM L-glutamina, 2 μ g/ml de insulina |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Factor de crecimiento reducido, sin rojo fenol |
| Essen ImageLock Placa de 96 pocillos, fondo plano | Essen | 4379 | |
| EVE Portaobjetos de conteo | BioTools | EVS-50 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-pocillos Invasión celular de la herida por arañazo accesorios | Essen | 4444 | Incluye CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Kit de migración de células | Essen | 4493 | Incluye el bloque de pines de 96 pocillos, 2x botes de lavado y el software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Sistema de análisis de células vivas | |
| Solución de insulina humana | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| Solución de L-glutamina (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Matraz de cultivo de tejidos, 75 cm2 área de crecimiento | Greiner Bio-One | 658175 |
Referencias
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Mo....
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Reimpresiones y permisos
