Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

Resumen

El éxito de un experimento de Cristalografía de femtosegundo serial tiempo resuelto es dependiente en la entrega de la muestra eficiente. Aquí, describimos protocolos para optimizar la extrusión de bacteriorhodopsin microcristales de un inyector micro-extrusión de alta viscosidad. La metodología se basa en la homogeneización de la muestra con un nuevo acoplador de tres vías y la visualización con una cámara de alta velocidad.

Resumen

Alta viscosidad micro-protuberancia inyectores han reducido dramáticamente el consumo muestra en serie femtosecond experimentos cristalográficos (SFX) en láseres de electrones libres de rayos x (XFELs). Una serie de experimentos utilizando el bacteriorhodopsin de bomba de protones impulsada por la luz más han establecido estos inyectores como una opción preferente para entregar cristales para Cristalografía de femtosegundo serial tiempo resuelto (TR-SFX) resolver los cambios estructurales de proteínas después de la fotoactivación. Para obtener múltiples copias instantáneas estructurales de alta calidad, es esencial para recoger grandes cantidades de datos y garantizar la separación de cristales entre cada pulso de láser de bomba. Aquí, describimos en detalle cómo hemos optimizado la extrusión de bacteriorhodopsin microcristales para nuestros experimentos recientes de TR-SFX en la fuente de luz coherente Linac (LCLS). El objetivo del método es optimizar la extrusión de un flujo estable y continuo manteniendo una alta densidad de cristales para aumentar la velocidad en que los datos pueden recogerse en un TR-SFX experimentar. Logramos este objetivo mediante la preparación de la fase cúbica lipídica con una distribución homogénea de cristales utilizando una jeringa de tres vías novedosa dispositivo seguido ajustando la composición de la muestra basada en medidas de la estabilidad de la protuberancia con una alta velocidad de enganche configuración de la cámara. La metodología puede adaptarse para optimizar el flujo de otros microcristales. La instalación estará disponible para los usuarios de las nuevas instalaciones de láser de electrón libre suizo.

Introducción

Femtosegundo serial Cristalografía (SFX) es una técnica de biología estructural que explota las propiedades únicas de láseres de electrones libres de rayos x (XFEL) para determinar estructuras de temperatura de miles de cristales de tamaño micrométrico y vencer la mayoría de el daño de la radiación por la "difracción antes de destrucción" principio^1,2,3.

En una extensión de tiempo-resolved de SFX (TR-SFX), los pulsos de femtosegundo del XFEL se utilizan para estudiar cambios estructurales en las proteínas^4,

Protocolo

1. preparación de la muestra de cristal de proteína

1. 30 minutos antes de que la muestra va a ser inyectado, carga 50 μl de monoolein cargados de cristal base LCP en jeringa de 100 μl.
2. Para la inyección a presión atmosférica: carga 10 μl de parafina líquida en la parte posterior de una segunda jeringa. Sosteniendo la jeringa verticalmente, expulsar las burbujas de aire de la jeringa.
   1. Para inyección en vacío ambiente: carga 5 μl de MAG 7.9 y 5 μl de parafina líquida en la parte posterior de una segunda jeringa. Sosteniendo la jeringa verticalmente, expulsar las burbujas de aire de la jeringa.
3. Conectar la jeringa con para....

Resultados

El material partido ideal para los procedimientos descritos aquí (figura 3) son altas densidades de microcristales incorporados en medio viscoso portador para el inyector. El procedimiento requiere aproximadamente 50 μl de portador cargado de cristal para cada preparación. Estos se puede cultivar directamente en LCP como con el bR^9,10 utilizado aquí como ejemplo (figura 4.......

Discusión

El método TR-SFX con el inyector de extrusión viscoso ha demostrado para ser una técnica viable para los estudios de la dinámica estructural de bacteriorhodopsin^9,10 y fotosistema II¹³ y ahora parece dispuesto a estudiar las proteínas conduce a otro procesos biológicos de la foto transporte iónico basados en luz como percepción sensorial^5,50. Los protocolos descritos anteriormente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acoplamiento de jeringa Mosquito LCP	TTP tienda de tecnología de laboratorio	3072-01050
Jeringa Hamilton 1710 RNR, 100 µ l	Hamilton	HA-81065
Jeringa Hamilton 1750 RNR, 500 y micro; l	Hamilton	HA-81265
Monooleína	Nu-Chek Prep, Inc.	M-239
7.9 MAG	Avanti Polar Lipids Inc.	850534O
50% p/v PEG 2000	Dimensiones moleculares	MD2-250-7
Parafina (líquida)	Sigma-Aldrich	1.07162
Cámara de alta velocidad	Photron Photron		Mini AX
Lente de gran aumento	Navitar		12X Sistema de lentes con zoom
tres ejes	ThorLabs	PT3/M
Fibra ligera	Thorlabs	OSL2
Fibra de sílice fundida	Molex/Polymicro	TSP-505375
Lite férula táctil	IDEX	LT-100
ASU Inyector de alta viscosidad ASU	Universidad Estatal de Arizona Comprable		en Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
Bomba de HPLC	Shimadzu	LC-20AD
Regulador de gas electrónico	Proporción Air	GP1