Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro

Resumen

Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Resumen

Remodelamiento óseo es un proceso complejo e implica períodos de deposición y reabsorción. La resorción ósea es un proceso por el cual hueso se descompone por osteoclastos en respuesta a diversos estímulos. Precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos multinuclear en respuesta a la colonia de macrófagos estimulando la factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL). En condiciones patológicas, el perfil de citoquinas es diferente y consiste en una mezcla de citoquinas inflamatorias. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) es una de las citoquinas más importantes ya que se encuentra en grandes cantidades en áreas involucradas con el osteolysis inflamatorio. El propósito de este protocolo es proporcionar un método por el cual médula ósea murina es aislada para generar osteoclastos a través de la inducción con el M-CSF y RANKL o TNF-α que se inhibirá posteriormente al aumentar la dosis de anticuerpo anti-c-fms, el receptor por M-CSF. Este experimento pone de relieve el valor terapéutico de los anticuerpos anti-c-fms en enfermedades de la resorción ósea inflamatoria.

Introducción

Los osteoclastos son células altamente especializadas, y se diferencian de las células madre hematopoyéticas a través de la fusión de varios precursores de osteoclastos. Son esenciales para la remodelación de hueso sano y contribuyen a la resorción del hueso patológico asociada con enfermedades osteolíticas inflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad periodontal¹.

Osteoclastogénesis y osteoclastos función es mediada por dos factores clave; macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando de factor nuclear kappa B (RANKL). M-CSF y RANKL son importantes para la diferenciación de los osteoclastos². Otro factor que se ha demostrado para inducir la formación de osteoclastos de macrófagos de médula ósea in vitro es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)^3,4,5. TNF-α mediada por osteoclastos formación ha demostrado ser crítica para osteólisis en enfermedades óseas destructivas como artritis reumatoide⁶,⁷de la enfermedad periodontal y osteoporosis postmenopáusica⁸.

C-fms es el receptor de membrana de M-CSF y media su acción. El papel de c-fms está bien documentado en la literatura como se ha demostrado que la administración de un anticuerpo contra c-fms (anticuerpo anti-c-fms) totalmente detenido osteoclastogénesis en un modelo de artritis así como en TNF-α inducida por erosiones del hueso mientras que osteoclastogénesis distante de la articulación inflamada estaba aún robusto⁹. Administración de anticuerpos anti-c-fms inhibe los osteoclastos formación y hueso la resorción inducida por lipopolisacárido (LPS) en ratón calvariae¹⁰ así como en la periodontitis inducida por LPS modelo¹¹. Además, anticuerpos anti-c-fms inhiben resorción de la raíz provocada por el estrés mecánico durante de movimiento dental ortodóncico¹², así como el movimiento dental ortodóncico y la resorción ósea asociada de movimiento ortodóntico del diente¹³.

M-CSF se ha divulgado para tener otras funciones que son esenciales para la respuesta inmune del huésped. La ausencia de M-CSF en ratones op/op con neumonía bacteriana conduce al aumento de la carga bacteriana y diseminación bacteriana al hígado con necrosis hepática¹⁴. Por lo tanto, M-CSF es importante para la respuesta inmunológica en la protección contra la infección.

Este estudio demuestra el efecto de anticuerpos anti-c-fms en el M-CSF y RANKL o TNF-α inducida por la formación de osteoclastos in vitro y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos. Este protocolo demuestra el aislamiento de células de médula ósea murina de los huesos largos y los pasos para generar los macrófagos de la médula (BMM) que son considerados como precursores de los osteoclastos para inducir la diferenciación de BMM en osteoclastos multinuclear por dos métodos; RANKL o TNF-α. El protocolo también compara la detención de osteoclastogénesis en ambos métodos usando el anticuerpo anti-c-fms.

El proceso por el cual médula es extraída y utiliza posteriormente para generar precursores de osteoclastos es confiable en la producción de grandes cantidades de cultivos de osteoclastos pura que pueden ser utilizados en múltiples aplicaciones posteriores como las pruebas de drogas. El uso de RANKL o TNF-α para inducir osteoclastogénesis en este protocolo distingue osteoclastogénesis como un proceso fisiológico (RANKL) de osteoclastogénesis como un proceso patológico (TNF-α), que a su vez proporciona dos procedimientos alternativos para guiar la decisión de que uno es superior en cuanto a los reactivos a utilizar en aplicaciones posteriores. Este protocolo también proporciona un método por el cual podemos determinar una concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms que pueden utilizar con seguridad para estudios posteriores en la resorción ósea y enfermedades osteolíticas.

Protocolo

Se realizaron todos los procedimientos animales y cuidado de los animales según el estatuto y el Reglamento de la Universidad de Tohoku.

1. manejo y disección de miembro posterior murino

1. Antes de la disección, llene un plato con unos 50 mL de α-MEM dependiendo del tamaño del recipiente y coloque en hielo. Esto servirá como un recipiente hasta que se completa la disección de todos los huesos. Para este y posteriores experimentos, usar α-MEM con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL.
2. Eutanasia el ratón C57Bl/6J por la inhalación de una sobredosis de 5% de isoflurano.
3. Fijar el ratón en una posición supina con pernos perforados a través de las palmas y pies y rocíe completamente con etanol al 70%.
4. Hacer una incisión en la piel con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas a la altura de la cadera y extienda hasta los pies, exponiendo los músculos.
5. Cortar el tendón adjuntando el músculo cuádriceps y el tendón adjuntando el músculo del tendón de la corva al hueso. Retire los músculos exponiendo las articulaciones cadera y rodilla. Localizar estos tendones facilitará la liberación de ambos músculos de sus accesorios sin dejar etiquetas blandas. No corte en el hueso.
6. Colocar la tijera entre la cabeza del fémur y el espacio común y corte en liberar el fémur pero manteniendo intacto el hueso. Esto permitirá la separación de los huesos sin el riesgo de exposición de la médula ósea.
7. Del mismo modo corte los músculos a la tibia. Cortar la tibia de su fijación en la articulación del tobillo manteniendo el hueso intacto para evitar la contaminación.
8. Raspe cualquier tejido blando restante de fémur y la tibia utilizando las tijeras cuchillas y kimwipe y colocar en una placa con α-MEM colocado en hielo.

2. aislamiento de médula trasera murino

1. Llene una jeringa de aguja de 30 G con α-MEM.
2. Desconecte la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla.
3. Corte los extremos de los huesos largos de ambos lados con unas tijeras.
4. Mantener el hueso del eje con unas pinzas, inserte la aguja en el espacio de la médula del hueso y enjuague lentamente el contenido de la médula en una placa de cultivo de 6 cm. El hueso aparece blanco, indicando que la extracción de todo el contenido de médula ósea. Repita para todos los huesos.
5. Tensión de la médula ósea extraer usando un colador de célula 40 μm nylon en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
6. Desechar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM, centrifugar a 300 x g durante 5 min lavado de repetición para un total de 2 veces.
7. Resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM y realizar un conteo usando un hemocitómetro como sigue:
   1. Hacer una dilución de 1:1 de la suspensión celular añadiendo 10 μL de la suspensión celular a 10 μL de tripano 0.4% azul en un tubo de 1,5 mL y pipetear una vez.
   2. Cubra la cámara del hemocitómetro con un tobogán y transferir la suspensión de tinte para el hemocitómetro. Es importante no sobrellene o llene la cámara y permite la suspensión llenar la cámara por capilaridad.
   3. Lugar el hemocitómetro sobre una platina del microscopio. Con el objetivo de 10 x, se centran en la Plaza del centro. Contar todas las células por 3 líneas. Para asegurarse de que las células no son contadas dos veces, contar las esquinas superiores y derecha de cada plaza. Las células muertas aparecerá azul oscuro, éstos quedan excluidos de la cuenta.
8. Dependiendo de la aplicación aguas abajo de la semilla las células en un recipiente apropiado de la cultura. Para este experimento particular, siga en la sección 3.

3. generación de BMM

1. Semilla 1 x 10⁷ células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO₂ durante 3 días.
2. Después de 3 días, eliminar el medio de cultivo, lavar las células vigorosamente con 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) dos veces para eliminar las células no adherentes, añadir 5 mL de temperatura ambiente 0.02% tripsina-EDTA en PBS e incubar a 37 ° C, 5% CO₂ durante 5 minutos.
3. Separar las células mediante pipeteo cuidadoso. Asegúrese de que las células han sido separadas mediante la observación de la cultura bajo un microscopio (las células deben aparecer redondeadas y flotantes en los medios de comunicación). Si las células permanecen adjuntas, repita Pipetear cuidadosamente para separarlos. Cuando las células han sido separadas, añadir 5 mL de α-MEM para inactivar la reacción.
4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g por 5 min, descartar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM.
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM.
6. Realizar un conteo como se describió anteriormente en el paso 2.7.1.
7. Semilla 1 x 10⁶ células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO₂ durante 3 días.

4. generación de osteoclastos de BMM como precursores de los osteoclastos

1. Después de 3 días, la cosecha las células adjuntas que representan BMM como precursores de los osteoclastos, siguiendo pasos 3.2-3.7.
2. BMM semilla en 5 x 10⁴ células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir RANKL para una concentración final de 50 ng/mL o TNF-α a una concentración final de 100 ng/mL. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.
3. Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada pocillo.
4. Incubar a 37 ° C, 5% CO₂ 4 días. Cambiar los medios de comunicación diariamente durante 4 días.

5. tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP)

1. Después de 4 días de incubación, aspirar suavemente el medio de cultivo de cada pozo. Lavar bien una vez con 200 μL de PBS 1 x de temperatura ambiente.
2. Añadir 200 μL de formalina al 10% a cada pocillo para la fijación e incubar 1 h a temperatura ambiente. Aspire el formol y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.
3. Añada 200 μL de 0,2% Tritón X-100 en PBS a cada bien de permeabilización e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspire el Triton X-100 y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.
4. Añadir 200 μL de solución de tinción de trampa a cada pocillo. Visualizar la mancha bajo el microscopio. Tardará de 10 a 30 min de la mancha desarrollar correctamente.
5. Aspirar la mancha y lavar cada pozo con agua desionizada 3 veces y seque al aire. Mantener a temperatura ambiente para utilizar en más de observación.

6. proliferación ensayo

1. BMM semilla como precursores de osteoclastos en 5 x 10³ células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.
2. Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubar a 37 ° C, 5% CO₂ para 3 días sin cambio de medio.
3. Después de 3 días, se lavan las células con PBS 1 x. Añada 100 μL de α-MEM en cada pocillo.
4. Añadir 10 μL de solución kit de conteo celular, incubar a 37 ° C, 5% CO₂ h 2 y determinar la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Resultados

El propósito de este protocolo es evaluar el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos en presencia de RANKL o TNF-α y determinar el efecto de M-CSF sobre la proliferación de precursores de osteoclastos. En este protocolo, hemos proporcionado un proceso confiable por el cual se generan grandes cantidades de cultivos puros de los osteoclastos. También hemos proporcionado una manera para probar la concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms para inhibir la formac...

Discusión

En este estudio, investigamos el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducida por RANKL, formación de osteoclastos inducida por el TNF-α y proliferación de precursores de osteoclastos inducida por el M-CSF. Se encontró que la cantidad efectiva de anticuerpos anti-c-fms para la inhibición de la osteoclastogénesis entre formación de osteoclastos inducida por RANKL, TNF-α inducida por osteoclastos formación y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos es diferente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		anti-c-Fms	AFS98, un anticuerpo monoclonal, antimurino, c-Fms (IgG2a) de rata,
TNF-y alfa;			TNF-&alpha murino recombinante preparado en nuestro laboratorio. TNF-y alfa; Fragmento de ADNc clonado por RT-PCR y clonado en un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para generar una proteína de fusión GST. GST-TNF-y alfa; se expresó en células BL21 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). Las células se lisaron en condiciones no desnaturalizantes y GST-TNF-α se purificó sobre una columna de glutatión-sefarosa. El GST fue escindido por PreScission Protease (Amersham Biosciences) por el fabricante' y fue eliminado por una columna de glutatión-Sepharose.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Liendo sRANK murino recombinante, Fuente: E. coli
M-CSF			humano recombinante. 1/10 vol de CMG14– Sobrenadante de cultivo de 12 líneas celulares a 5x106  células en una placa de cultivo en suspensión de 10 cm.
α-MEM	Wako		con L-Glutamina y rojo fenol
Suero fetal bovino	Biowest	s1820-500	Suero fetal bovino
	Corning Plato estilo		100 mm x 20 mm
Plato de 96 pocillos	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta de superficie
Kit de recuento de células-8	Dojindo, Kumamoto, Japón
Lector de microplacas	Sunrise REMOTE; Tekan Japón, Kawasaki, Japón
Colador de celdas	Corning		40 μ m
Tubo de centrífuga	Corning		50 mL Tapón
CentriStar Triton X-100	Wako		Polioxietileno (10) Éter de octilfenilo

Anticuerpo Plato de cultivo de origen francés de nailon