Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Resumen

RNA de doble hebra producido durante la replicación de virus de ARN puede ser reconocido por los receptores de reconocimiento de patrón para inducir una respuesta inmune innata. Virus de ARN de sentido negativo, la interacción entre el bajo nivel dsARN y PRRs sigue siendo confusa. Hemos desarrollado un método de microscopia confocal para visualizar arenavirus dsARN y PRR en células individuales.

Resumen

(Ds) RNA de doble cadena se produce como un intermediario replicativo durante la infección de virus de ARN. Reconocimiento de dsRNA por receptores de reconocimiento de patrón host (PRRs) como el ácido retinoico (RIG-I) como receptores (RLRs) RIG-I y melanoma proteína asociada a la diferenciación 5 (MDA-5) conduce a la inducción de la respuesta inmune innata. La formación y la distribución intracelular de dsARN en infección por virus de ARN de sentido positivo se ha caracterizado bien por microscopía. Muchos virus de ARN de sentido negativo, incluyendo algunos arenavirus, desencadenan la respuesta inmunitaria innata durante la infección. Sin embargo, los virus de ARN de sentido negativo pensaron para producir niveles bajos de dsRNA, que dificulta el estudio de reconocimiento de la PRR de dsRNA viral. Además, los experimentos de infección con el virus altamente patógeno deben realizarse en instalaciones de nivel de seguridad de la biotecnología de alta contención (BSL-4). La interacción entre virus ARN y PRRs para el altamente patógeno virus de ARN es desconocida debido a los desafíos técnicos adicionales que necesitan los investigadores para enfrentar en las instalaciones del BSL-4. Recientemente, un anticuerpo monoclonal (Mab) (clon 9 5) originalmente utilizado para la detección de enterovirus de pan se ha encontrado para detectar específicamente dsRNA con una sensibilidad mayor que los anticuerpos de anti-dsRNA tradicionales J2 o K1. En el presente, mediante la utilización de la 5 9 anticuerpos, se describe un protocolo de microscopía confocal que se ha utilizado con éxito para visualizar dsRNA, proteína viral y PRR simultáneamente en células individuales infectadas por arenavirus. El protocolo también es adecuado para estudios de dsARN y distribución de PRR en arenavirus patógenos infectadas células en BL4 instalaciones de imagen.

Introducción

El paso inicial de la inducción de la respuesta inmune innata es reconocimiento del hospedero de doble cadena (ds) RNA por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) como el ácido retinoico (RIG-I) como receptores (RLRs) RIG-I y melanoma asociado a diferenciación proteína 5 (MDA-5)¹. Para virus de ARN de sentido positivo, dsRNA puede generalmente ser detectado fácilmente utilizando el J2 o K1 dsARN anti anticuerpos monoclonales (Mab)². Interacción entre dsARN y PRRs en virus de ARN de cadena positiva, como picornavirus, se ha caracterizado mediante microscopía confocal³. Sin embargo, para v....

Protocolo

1. preparación de las células A549 y JUNV infección

1. Semilla 2 x 10⁵ pulmón humano A549 las células epiteliales en poly-D-lisina (PDL) habían revestido cubreobjetos de vidrio en placas de pocillos de 12 a 24 horas antes de la infección.
2. Preparar alícuotas de 150 mL de JUNV¹³ en una multiplicación de la infección (MOI) de 1,0 placa formando unidad por elemento diluido en los medios de medio (DMEM) modificado Eagle de Dulbecco suplementados con 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina (P/S ).
3. Retire los medios de cultivo celular. Añadir inóculo del virus en cada bien que contienen ....

Resultados

Este protocolo se aplicó para estudiar la distribución y colocalización entre el RLRs (RIG-I y MDA-5) y dsRNA en células infectadas con JUNV. Como se muestra en la figura 1 y figura 2, la acumulación de dsARN aumenta con el tiempo conforme avanza la infección viral. Concentrado MDA-5 (figura 1) y plataforma-I (figura 2) las señales encontradas colocalized con las estruct.......

Discusión

Virus de ARN de sentido positivo y virus dsDNA, dsRNA se detecta fácilmente con el anticuerpo de anti-dsRNA J2 ampliamente utilizado. Sin embargo, los virus de ARN de sentido negativo se creen para producir dsRNA en un bajo o por debajo del nivel de detección utilizando el mismo anticuerpo². Así, muchos aspectos de la interacción viral de RNA y PRR son en gran parte confusos para los virus de ARN de sentido negativo. Hemos intentado manchar de dsARN en infección por arenavirus usando el anticuerpo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de marcaje de anticuerpos APEX Alexa Fluor 647	Invitrogen	A10475
BSA	Sigma Aldrich	A4503
DAPI	Cell Signaling	4083	1:1.000
Donkey-anti conejo Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-11058	dilución 1:2.000; Lote #: 1454437
Dulbecco's Eagle's modificado Medio Corning		10-013-CV
Suero fetal bovino	Atlanta Bio	S11150
Portaobjetos de microscopio de vidrio	Fisher	12-550-15
Cabra-anti ratón Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029	dilución 1:2000; Lote #: 1874804
Células epiteliales de pulmón humano A549	ATCC	CCL-185
Metanol	Fisher	A412	Almacenado a -20 ° C
Ratón MAb anti-JUNV NP	BEI	NA05-AG12	Conjugado con Alexa-647 con una dilución de 1:1.000
Ratón MAb pan-Enterovirus 9D5 Reactivo	Millipore Sigma	3361	listo para usar; diluido a 1:2; Lote #: 3067445
PBS suplementado con Ca y Mg	Corning	21-030-CV
PDL Cubreobjetos recubiertos	Neuvitro	H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antidecoloración	Invitrogen	P10144
Rabbit MAb MDA-5	Abcam	ab126630	dilución 1:250; Lote #: GR97758-7
cepa Candid#1 rerecomendada de JUNV	Lab generada	por Lab Como	se describió anteriormente en la referencia 13.
RIG-I ratón MAb conjugado con Alexa-594	Santa Cruz	sc-376845	dilución 1:1000; Lote #: AO218
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787