Adsorción de esporas como un sistema de visualización Nonrecombinant para enzimas y antígenos

Resumen

Este protocolo se centra en el uso de esporas bacterianas como una herramienta "viva" nanobiotechnologicos para adsorber moléculas heterólogas con diversas actividades biológicas. También se muestran los métodos para medir la eficiencia de adsorción.

Resumen

La espora bacteriana es una célula metabólicamente quiescente, formada por una serie de capas protectoras que rodean un citoplasma deshidratado. Esta peculiar estructura hace la espora extremadamente estable y resistente y ha sugerido el uso de la espora como una plataforma para mostrar las moléculas heterólogas. Hasta ahora, una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido en las esporas de Bacillus subtilis y de algunas otras especies, inicialmente por un enfoque recombinante y, luego, por un método sencillo y eficaz nonrecombinant. El sistema de visualización nonrecombinant se basa en la adsorción directa de moléculas heterólogas en la superficie de la espora, evitando la construcción de cepas recombinantes y la liberación de bacterias genéticamente modificadas en el medio ambiente. Las moléculas adsorbidas son estabilizadas y protegidas por la interacción con las esporas, que limita la degradación rápida de antígenos y la pérdida de actividad de la enzima en condiciones desfavorables. Una vez utilizado, enzimas esporas adsorbidos pueden ser recogidas fácilmente con una mínima reducción de la actividad y reutilizadas para rondas de reacción adicional. En este artículo se muestra cómo adsorber moléculas modelo purificada esporas de B. subtilis, cómo evaluar la eficiencia de adsorción y cómo recoger esporas usadas para reciclarlas para nuevas reacciones.

Introducción

Sistemas de visualización están dirigidos a presentar moléculas biológicamente activas en la superficie de los microorganismos y encontrando aplicaciones en diversos campos, de industrial a biotecnologías médicas y ambientales. Además de phages^1,2 y las células de varios Gram-negativos - positivos y especies^3,4,5,6,7, esporas bacterianas han sido propuesto como sistemas de visualización por dos enfoques^8,

Protocolo

1. reacción de adsorción de

1. Incubar 2, 5 y 10 μg de mRFP con 2 x 10⁹ esporas purificadas de B. subtilis tipo salvaje en 200 μL de binding buffer, citrato de sodio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sodio dihidrato, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1 h a 25 ° C en un agitador oscilante (figura 1) .
2. Centrifugar la mezcla obligatoria (13.000 x g por 10 min) para fraccionar pellets (P2, P5 y P10) y sobrenadantes (S2, S5 y S10). Guarde el sobrenadante para la evaluación indirecta de la eficacia de adsorción que se describe en el paso 3.2.
3. Lavar los gránulos 2 x con 200 μL de tampón y resus....

Resultados

Adsorción de éxito puede ser evaluada por western blot. En la reacción, la mezcla se fracciona mediante centrifugación y lavada, y la fracción de sedimento (figura 1) se utiliza para extraer las proteínas de la superficie. El extracto se fracciona por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro y reaccionó contra anticuerpos primarios y secundarios. La presencia de proteínas del .......

Discusión

Este protocolo de adsorción de esporas es muy sencillo. La reacción es estrictamente dependiente del pH del buffer de reacción y la eficiencia de adsorción es óptima a valores de pH ácido (pH 5.0 o inferior). En condiciones de pH neutro, la eficiencia de adsorción es baja, y en los valores de pH alcalino, no puede ocurrir adsorción. Adsorción óptima se obtiene con un volumen de 200 μL en tubos de 1,5 mL (o manteniendo una relación similar) en un agitador oscilante.

Adsorción es muy apretado, y.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de poli-L-lisina al 0,1%	Sigma	P8920
0,45 µ m Membrana absorbente de nitrocelulosa	Sartorius M_Blotting_Membranes
100 veces; objetivo UPlanF1		de microscopio	Olympus
Bacillus subtilis  cepa NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1
BD ACCURI C6 PLUS	BD	citómetro
BX51	Olympus	Microscopio
Clarity	Biorad	1705060
cámara digital DP70 un		microscopio	Olympus
Cabra anti-conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, FITC	Thermo fisher	F-2754
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP)	Abcam	ab6721
Anti-polihistidina monoclonal− Anticuerpo peroxidasa	Sigma	A7058-1VL	utilizado para detectar proteínas adsorbidas que presentan una marca 6xhistidina en el terminal C o N
Deslizamiento seguro  cubreobjetos de vidrio	Sigma	S1815-1PAK
Superwhite Portaobjetos de microscopio sin carga	VWR	75836-190
U-CA Cambiador de aumento		de microscopio	Olympus

Equipo de flujofluorescente equipo de Equipos