Artículo de método

Adsorción de esporas como un sistema de visualización Nonrecombinant para enzimas y antígenos

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DOI:

10.3791/59102

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19 de marzo de 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Federico II University, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

En este artículo

Resumen

Este protocolo se centra en el uso de esporas bacterianas como una herramienta "viva" nanobiotechnologicos para adsorber moléculas heterólogas con diversas actividades biológicas. También se muestran los métodos para medir la eficiencia de adsorción.

Resumen

La espora bacteriana es una célula metabólicamente quiescente, formada por una serie de capas protectoras que rodean un citoplasma deshidratado. Esta peculiar estructura hace la espora extremadamente estable y resistente y ha sugerido el uso de la espora como una plataforma para mostrar las moléculas heterólogas. Hasta ahora, una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido en las esporas de Bacillus subtilis y de algunas otras especies, inicialmente por un enfoque recombinante y, luego, por un método sencillo y eficaz nonrecombinant. El sistema de visualización nonrecombinant se basa en la adsorción directa de moléculas heterólogas en la superficie de la espora, evitando la construcción de cepas recombinantes y la liberación de bacterias genéticamente modificadas en el medio ambiente. Las moléculas adsorbidas son estabilizadas y protegidas por la interacción con las esporas, que limita la degradación rápida de antígenos y la pérdida de actividad de la enzima en condiciones desfavorables. Una vez utilizado, enzimas esporas adsorbidos pueden ser recogidas fácilmente con una mínima reducción de la actividad y reutilizadas para rondas de reacción adicional. En este artículo se muestra cómo adsorber moléculas modelo purificada esporas de B. subtilis, cómo evaluar la eficiencia de adsorción y cómo recoger esporas usadas para reciclarlas para nuevas reacciones.

Introducción

Sistemas de visualización están dirigidos a presentar moléculas biológicamente activas en la superficie de los microorganismos y encontrando aplicaciones en diversos campos, de industrial a biotecnologías médicas y ambientales. Además de phages1,2 y las células de varios Gram-negativos - positivos y especies3,4,5,6,7, esporas bacterianas han sido propuesto como sistemas de visualización por dos enfoques8,9.

Debido a su peculiar estructura, es decir, un citoplasma deshidratado rodeado por una serie de capas protectoras10, la espora proporciona varias ventajas sobre phage y celular basado en pantalla sistemas8,9. Una primera ventaja viene de la extrema robustez y estabilidad de las esporas en las condiciones que serían perjudiciales para todos otros células10,11. Enzimas y antígenos aparecen esporas son estables después de prolongado almacenamiento a temperatura ambiente12 y protegido de la degradación a pH bajo y altas temperaturas13. Una segunda ventaja de las esporas es la seguridad de muchas especies formadoras de esporas. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansy varias otras especies se utilizan como probióticos y han estado en el mercado para uso humano o animal por décadas14,15. Este expediente excepcional de seguridad es un requisito general obvio para un sistema de visualización superficial y es de particular relevancia cuando el sistema está diseñado para uso humano o animal16. Una tercera ventaja importante de un sistema de visualización basado en esporas es que no tiene limitaciones para el tamaño de la molécula que tiene que ser expuesto. En sistemas basados en el fago, una gran proteína heteróloga puede afectar la estructura de la cápside, mientras que en sistemas basados en celular, puede afectar la estructura de la membrana o límite/perjudiquen la membrana desplazamiento paso17. Las capas protectoras alrededor de la espora se componen de más de 70 diferentes proteínas10 y son lo suficientemente flexibles como para aceptar grandes proteínas extrañas sin ningún defecto estructural evidente o debilitación funcional8. Además, con ambos sistemas de visualización basado en esporas, el desplazamiento de la membrana de la proteína heteróloga no es necesario8,9. De hecho, proteínas heterólogas son producidas en el citoplasma de la célula madre y montadas en la espora que se forma en el mismo citoplasma o fijado por adsorción en la espora madura8,9.

Visualización de esporas se obtuvo inicialmente mediante el desarrollo de un sistema genético para diseñar la superficie de la espora18. Este sistema genético se basa en) la construcción de una fusión génica entre el gen que codifica para una proteína de la capa de espora (utilizada como un portador) y el gen que codifica para que la proteína que aparece - la presencia de las señales transcripcionales y traduccional de la endógena gen controla la expresión de la fusión y ii) integración del gen quimérico en el cromosoma B. subtilis a otorgar estabilidad genética. Una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido por este enfoque recombinante, utilizando diferentes proteínas de superficie de la espora como portadores y con el objetivo de varias aplicaciones potenciales, desde vacuna mucosa biocatalítica, biosensor, biorremediación, o Bioanalytical herramienta8,13.

Más recientemente, un enfoque diferente de pantalla de spore ha sido desarrollado19. Este segundo sistema es nonrecombinant y se basa en la adsorción de moléculas sobre la superficie de la espora9espontánea y muy apretada. Los antígenos19,20 y enzimas13,21 han exhibido eficientemente y han revelado que este método es significativamente más eficiente que el recombinante. Este enfoque nonrecombinant permite la visualización de proteínas en la forma nativa20 y también puede utilizarse con autoclave, esporas de muerte19. El mecanismo de adsorción molecular ha no totalmente aclarado todavía. La carga negativa y la hidrofobicidad de la espora se han propuesto como propiedades relevantes para la adsorción13,19,22. Recientemente, se ha demostrado que una proteína modelo, la proteína roja autofluorescent (mRFP) de la coral Discosoma, cuando adsorbido a la espora, fue capaz de infiltrarse a través de las capas superficiales que se localiza en la capa interior23. Si cierto para otras proteínas, la localización interna de las proteínas heterólogas podría explicar su mayor estabilidad cuando se adsorbe a las esporas23.

En un estudio reciente, dos enzimas que catalizan dos pasos sucesivos de la vía de degradación de xilano independientemente fueron exhibidas en las esporas de B. subtilis y, cuando se incuban juntos, eran capaces de realizar ambos pasos degradación del21. Las esporas recogieron después de la reacción todavía activos y capaces de continuar la degradación de xilano con la adición de sustrato fresco21. Aunque se observó una pérdida de alrededor del 15% del producto final en la segunda reacción21, la reutilización de las enzimas adsorbidas por reacciones individuales, así como varios pasos, es una ventaja importante adicional del sistema de visualización de esporas.

Pan et al.24 informaron un enfoque adicional para visualizar proteínas heterólogas en la superficie de la espora: proteínas heterólogas (una proteína endoglucanase y una beta-galactosidasa uno) producidas en la célula madre durante la esporulación fueron espontáneamente dentro de la capa de espora formación, sin la necesidad de un operador. Este sistema de visualización de esporas adicional es una combinación de los dos enfoques descritos hasta ahora. De hecho, es recombinante ya que las proteínas heterólogas fueron diseñadas para ser expresados en la célula madre durante la esporulación, aunque su montaje dentro de la capa fue espontánea y, por tanto, nonrecombinant24. Sin embargo, la eficacia de la exhibición de este enfoque adicional queda probado y Comparado con los otros dos enfoques mediante el uso de las mismas proteínas heterólogas.

El presente Protocolo excluye los procesos de producción de esporas y purificación, que han sido descritos ampliamente en otra parte24. Incluye la reacción de adsorción, la evaluación de la eficiencia de adsorción por microscopia dot-blotting y fluorescencia, y el reciclaje de enzimas adsorbidas para reacción adicional rondas.

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Protocolo

1. reacción de adsorción de

  1. Incubar 2, 5 y 10 μg de mRFP con 2 x 109 esporas purificadas de B. subtilis tipo salvaje en 200 μL de binding buffer, citrato de sodio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sodio dihidrato, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1 h a 25 ° C en un agitador oscilante (figura 1) .
  2. Centrifugar la mezcla obligatoria (13.000 x g por 10 min) para fraccionar pellets (P2, P5 y P10) y sobrenadantes (S2, S5 y S10). Guarde el sobrenadante para la evaluación indirecta de la eficacia de adsorción que se describe en el paso 3.2.
  3. Lavar los gránulos 2 x con 200 μL de tampón y resuspender en 100 μl de enlace del almacenador intermediario y usan para el siguiente análisis obligatorios.
    Nota: La reacción de enlace se produce preferentemente en un valor de pH más bajo que el punto isoeléctrico de la proteína; por lo general, 1,5 M tampón fosfato salino (PBS), pH 4.0, o citrato de sodio 50 mM, pH 4.0, se utilizan.

2. directa evaluación de la eficiencia de adsorción

  1. Extracción de proteínas de la superficie y el análisis de western blot
    1. Tomar 50 μl de resuspensión de las esporas mRFP adsorbido (P2, P5 y P10 de paso 1.3) y añadir 50 μl de 2 x sodio dodecil sulfato (SDS)-dithiothreitol (DTT) (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 0,1 M TDT) para solubilizar proteínas de superficie de la espora.
    2. Utilice el mRFP gratis, purificado y extractos de la misma cantidad de esporas que no son adsorbidas a la proteína como controles positivos y negativos, respectivamente.
    3. Después de 45 min de incubación a 65 ° C, centrifugar (13.000 x g por 10 min) las mezclas y analizar 10 μl de las proteínas extraídas (sobrenadante) por western blot con el monoclonal anticuerpo anti-su reconocimiento de su etiqueta presente en el N-terminal de mRFP ( Figura 2A).
  2. Observaciones de microscopía fluorescente
    Nota: Por medio de proteínas heterólogas fluorescentes o realizar un análisis de la inmunofluorescencia, es posible localizar y cuantificar las moléculas adsorbidas por microscopía de fluorescencia.
    1. 5 μl de resuspensión de las esporas adsorbido en el paso 1.3 y añadir 95 μl de PBS 1 x, pH 4.0, obtener ~ 1 x 106 esporas/μl.
    2. Lugar 5 μl de la suspensión en un portaobjetos, cubrirla con un cubreobjetos previamente tratado con poli-l-lisina por 30 s y observarlo bajo un microscopio de fluorescencia.
    3. Para cada campo, guardar la imagen de microscopía de contraste de fase y la imagen de microscopía de fluorescencia (figura 2B).
      Nota: Alternativamente, las esporas fluorescentes pueden ser analizadas por cytofluorimetry. Resuspender un total de 106 esporas adsorbidos o no adsorbida con la proteína heteróloga en 1 mL de PBS 1 x, pH 4.0 y analiza la suspensión utilizando un citómetro de flujo (figura 2C).
  3. Análisis de datos con ImageJ
    1. Abra las imágenes de microscopía de fluorescencia con el software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) y asegúrese de que todas las imágenes están en el formato de 8 bits (imagen | Tipo | 8-bit).
    2. Ajustar el contraste si es necesario (imagen | Ajustar | Brillo contraste) y compruebe que la escala de la imagen PIXEL (imagen | Establecer la escala).
    3. En el menú analizar, seleccione establecer mediciones. Asegúrese de que áreay Densidad integrado Significa gris valor seleccionado.
    4. Trace una línea alrededor de la espora de interés utilizando cualquiera de las herramientas de dibujo y selección (es decir, círculo, polígono, o forma libre) (figura 3).
    5. Seleccione medida en el menú de analizar (o presione cmd + M). Un cuadro emergente con una pila de valores para este primer espora aparece (figura 3).
    6. Repita estos dos pasos para al menos 50 otras esporas en el campo de vista elegido para medirla.
    7. Seleccionar varias regiones sin cualquier esporas (que no tienen ninguna fluorescencia) y repetir la medición; Este será el fondo.
      Nota: El tamaño no es importante. Estos valores de fluorescencia de fondo se utilizará para restar manualmente el fondo.
    8. Seleccione todos los datos en la ventana resultados y copiar los resultados en una hoja de cálculo.
    9. Calcular la media de la Densidad integrado y área de las esporas seleccionadas y de los valores de fluorescencia de fondo y usarlos para obtener la corrección total por celda fluorescencia (CTCF) utilizando la fórmula: CTCF = media integrado Densidad - (área media x fluorescencia media del fondo).
      Nota: Como alternativa, si las esporas aparecen bien separadas, es posible analizar todas las esporas del campo de la imagen utilizando la función de Analizar partículas, siguiendo instrucciones de ImageJ. Para evitar que el software lee una fluorescencia específica o agregados de espora, la dimensión de las partículas se ha establecido en pixelˆ2 = 50-200 (figura 4).

3. indirecta evaluación de la eficiencia de adsorción

  1. Preparar diluciones seriadas de la proteína purificada.
    1. Preparar un primer tubo de 1,5 mL que contiene 250 μl de mRFP purificada a una concentración final de 0.5 ng/μl, utilizando el tampón de Unión. Este volumen es suficiente para dos carriles de carga.
    2. Realizar seis doble diluciones seriadas de 250 μl (volumen final) cada uno, usando el tampón de Unión.
  2. Se preparan dos diluciones seriadas de las muestras sobrenadante que contiene la fracción no unida mRFP de la reacción de adsorción (S2, S5 y S10 en el paso 1.2).
    1. Ponga 100 μl de cada sobrenadante en un tubo de 1,5 mL y añadir 100 μl de tampón de Unión. Realizar seis doble diluciones seriadas de 200 μl (volumen final) cada uno, usando el tampón de Unión.
  3. Corte una nitrocelulosa membrana (0,45 μm límite), 9 cm x 10 cm de tamaño, para cubrir el área de (número de muestras) de 5 x 6 puntos (número de diluciones). La membrana no debe extenderse más allá del borde de la Junta del aparato dot blot.
  4. Coloque la membrana prewet en el aparato de dot blot. Eliminar burbujas de aire atrapados entre la membrana y la Junta. Cubrir la parte no utilizada del aparato con cinta o parafina película para evitar que el aire se mueva a través de los pozos.
  5. Montar el aparato de dot blot según lo descrito por el fabricante.
  6. Si un vacío se utiliza durante el montaje, rehidratar la membrana con 100 μl de 1 x PBS por pozo para garantizar la fijación uniforme del antígeno y evitar halos o una señal de detección débil.
  7. Retire suavemente el tampón de los pozos al vacío. Tan pronto como el tampón de drenes de los pozos, parar la bomba de vacío y desconéctela.
  8. Cargar el estándar en los dos carriles más exteriores y las muestras en el centro (figura 5). Rellenar los pocillos adecuados con 100 μl de cada dilución. El mismo volumen utilizado para cada pozo debe asegurar una filtración homogénea de todos los pozos de muestra.
  9. Encienda la bomba de vacío durante 2 min., detenerla y luego, deje que la muestra a filtrar a través de la membrana por flujo de gravedad.
  10. Lavar todos los pocillos con 100 μl de 1 x PBS y dejar que la bomba de vacío funcionan para otros 5 minutos después el tampón de lavado ha sido completamente vaciada del aparato.
  11. Con el vacío, afloje los tornillos y abra con cuidado el aparato de dot blot.
  12. Apague la aspiradora, tomar la membrana y procesan siguiendo un protocolo de inmunoblot.
  13. Realizar un análisis densitométrico del filtro, usando el software apropiado, como el ImageJ.
    1. Medir la densidad integrada de cada punto de esbozar con un círculo de la misma zona y utilizar el comando Analyze/medida .
    2. Hacer una corrección de fondo de la imagen, dibujando un círculo en un área vacía y medir su densidad integrado o usando el comando de Proceso/restar fondo .
    3. La densidad integrada de los puntos estándar se correlacionan con la cantidad de proteína cargada y obtener una línea de calibración (valores de R2 para la calibración de las curvas deben ser sobre 0.95).
    4. Utilice la curva de calibración para extrapolar la concentración de mRFP de cada punto de muestra.
    5. Calcular la concentración de mRFP restante de las fracciones no Unidas.
      Nota: Para asegurar el cierre correcto del aparato de la mancha blanca /negra del punto y, por tanto, sujeto la membrana a una presión uniforme, apriete los tornillos siguiendo un esquema diagonalmente cruzado y, a continuación, abra la bomba de vacío para apretar los tornillos más fuertemente.

4. colección de la espora y reutilizar

  1. Para el reciclaje de la espora adsorbida, realizar dos reacciones de adsorción de 2.0 x 10 esporas9 purificada con 10 μg de xilanasa de GH10-XA purificada o 10 μg de purificada GH3-XT β-xylosidase, como se describe en los pasos 1.1-1.3 (figura 6A).
  2. Recoger los pellets que contiene las esporas enzima adsorbida, resuspender en 50 μl del buffer óptimo para el análisis de la reacción enzimática (50 mM de tampón fosfato de sodio a pH 6,5; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 contabilidad NaH2PO4), y mezclar para obtener una mezcla de 100 μl de esporas adsorción GH10-XA o GH3-XT.
  3. Añadir el sustrato (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) y que las reacciones enzimáticas tienen lugar de 16 h a 65 ° C.
  4. Centrifugar la mezcla de reacción (por 15 min a 13.000 x g) y guarde el sobrenadante que contiene el producto de reacción de la enzima.
  5. Resuspender el sedimento en 100 μl de buffer de fosfato de sodio fresco 50 mM a pH 6.5 en presencia de un nuevo substrato (MGX) (figura 6B).
    Nota: Para absorber más de una enzima, es posible para ambos juntos o uno por uno independientemente. La última posibilidad facilita el análisis cuantitativo de la eficacia de adsorción y de la actividad de cada enzima, permitiendo un balance estequiométrico de cada enzima necesaria para las reacciones.

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Resultados

Adsorción de éxito puede ser evaluada por western blot. En la reacción, la mezcla se fracciona mediante centrifugación y lavada, y la fracción de sedimento (figura 1) se utiliza para extraer las proteínas de la superficie. El extracto se fracciona por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro y reaccionó contra anticuerpos primarios y secundarios. La presencia de proteínas del ...

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Discusión

Este protocolo de adsorción de esporas es muy sencillo. La reacción es estrictamente dependiente del pH del buffer de reacción y la eficiencia de adsorción es óptima a valores de pH ácido (pH 5.0 o inferior). En condiciones de pH neutro, la eficiencia de adsorción es baja, y en los valores de pH alcalino, no puede ocurrir adsorción. Adsorción óptima se obtiene con un volumen de 200 μL en tubos de 1,5 mL (o manteniendo una relación similar) en un agitador oscilante.

Adsorción es muy apretado, y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por "Libro di Ricerca di Ateneo" a L. Baccigalupi, título del proyecto "SP-LAY: esporas bacterianas como la plataforma live para la visualización de las proteínas".

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de poli-L-lisina al 0,1%SigmaP8920
0,45 µ m Membrana absorbente de nitrocelulosaSartorius M_Blotting_Membranes
100 veces; objetivo UPlanF1 de microscopioOlympus
Bacillus subtilis  cepa NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1
BD ACCURI C6 PLUSBDcitómetro
BX51OlympusMicroscopio
ClarityBiorad1705060
cámara digital DP70 unmicroscopioOlympus
Cabra anti-conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, FITCThermo fisherF-2754
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP) Abcamab6721
Anti-polihistidina monoclonal− Anticuerpo peroxidasaSigmaA7058-1VLutilizado para detectar proteínas adsorbidas que presentan una marca 6xhistidina en el terminal C o N 
Deslizamiento seguro  cubreobjetos de vidrioSigmaS1815-1PAK
Superwhite Portaobjetos de microscopio sin cargaVWR75836-190
U-CA Cambiador de aumento de microscopioOlympus
Equipo de flujofluorescente equipo de Equipos

Referencias

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