Este protocolo describe procedimientos experimentales para caracterizar el genoma cambios en los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTM) que ocurre en relación con la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la ELA y la enfermedad de Parkinson en Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Después de la separación de SDS-PAGE, se detectan niveles PTM de las histonas individuales con anticuerpos específicos a la modificación mediante Western blot.
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Artículo de método
Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura
En este artículo
Resumen
Resumen
Enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP), causan la pérdida de cientos de miles de vidas cada año. Se carecen de opciones de tratamiento efectivo capaces de detener la progresión de la enfermedad. A pesar de los esfuerzos extensos de la secuencia en grandes poblaciones de pacientes, la mayoría de los casos de ELA y PD siguen siendo inexplicable por mutaciones genéticas solo. Mecanismos de epigenética, como la modificación poste-de translación de proteínas histonas, pueden estar involucrados en la progresión y la etiología de la enfermedad neurodegenerativa y conducen a nuevas dianas de intervención farmacéutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro de ALS y PD son costosos y a menudo requieren protocolos experimentales prolongados y laboriosos. Aquí describiremos un enfoque práctico, rápido y rentable para determinar alteraciones del genoma en los niveles de modificación de las histonas mediante Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. Este protocolo permite investigaciones integrales sobre cambios epigenéticos conectadas proteinopatías neurodegenerativas que corroboran los resultados anteriores en sistemas modelo diferentes al mismo tiempo ampliar significativamente nuestro conocimiento de la epigenoma de enfermedades neurodegenerativas.
Introducción
Las enfermedades neurodegenerativas son devastadoras enfermedades con poca o ninguna opción de tratamiento disponible. Entre estos, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP) son particularmente terrible. Aproximadamente el 90% de casos de ALS y PD se considera esporádico, que ocurre sin antecedentes familiares de la enfermedad, mientras que el resto de los casos se presentan en familias y generalmente está ligado a una mutación gen específico1,2. Curiosamente, dos de estas enfermedades se asocian con proteínas mislocalization y agregación3,
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Protocolo
1. transformación de S. cerevisiae con neurodegenerativas proteína asociada a la proteinopathy construcciones
- Crecer la levadura 303 tipo salvaje (WT) en caldo de dextrosa (YPD) de peptona de extracto de levadura durante la noche con agitación (200 rpm) a 30 ° C.
- Después 12−16 h de crecimiento, diluir la levadura a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0.25 con YPD. Como 10 mL de cultivos líquidos de levadura se necesitarán para cada transformación, preparar 50 mL de cultivos líquidos de levadura para cinco transformaciones correspondientes a FUS, TDP-43, a-sinucleína y vector único (ccdB) construcciones, así como una transfor....
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Resultados
Para ilustrar este método, tomaremos ventaja de resultados recientemente publicados30. FUS humano WT y TDP-43 se sobreexpresa de 5 horas, mientras que WT α-sinucleína se sobreexpresa de 8 h. Una construcción ccdB fue utilizada como un control negativo de vector. La figura 2 muestra la supresión del crecimiento en cultivos sólidos y líquidos. La levadura fue cosechada como se describe y Western Blot con anticuerpos específicos de modifi.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí proporciona una manera sencilla, conveniente y rentable de la categorización de cambios PTM genoma histona con neurodegenerativas proteinopatías. Mientras que hay otros modelos de ALS y PD, como en vitro líneas celulares humanas y murinas modelos32, restos de S. cerevisiae atractivos debido a su facilidad de uso. Por ejemplo, modelos de levadura no requieren el uso de una capucha estéril, ni necesitan el intensivo entrenamiento va junto con el trabajo d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf y Sadiqa Taasen ayuda técnica. Estamos muy agradecidos con el Prof. James Shorter por la generosa provisión de reactivos y ayuda intelectual en el diseño de los experimentos de afinación de sacarosa. Plásmidos de la levadura fueron una generosa donación de la Prof. Aaron Gitler (incluyendo 303Gal-FUS; Plásmido Addgene # 29614). Brooklyn College y la avanzada ciencia investigación centro (CUNY) así como un NIH NINDS avanzado Postdoctoral transición Premio (K22NS09131401) admite M.P.T.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| -Su suplemento de OD | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141,65 g de glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodecil sulfato de sodio (Sigma-Aldrich L3771) y 1 L de agua desionizada, pH 8,8. | ||
| 12% Geles de poliacrilamida | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Antiacetil-histona H3 (Lys14) Anticuerpo primario | MilliporeSigma | 07-353 (Lote Nº 2762291) | Dilución: 1/1000 |
| Antiacetil-histona H4 (Lys 16) Anticuerpo primario | Abcam | ab109463 (Lote Nº. GR187780) | Dilución: 1/2000 |
| Anticuerpo primario antiacetil-histona H4 (Lys12) | Abcam | ab46983 (Lote No. GR71882) | Dilución: 1/5000 |
| Anticuerpo primario anti-dimetil-histona H3 (Lys36) Abcam | ab9049 (Lote No. GR266894, GR3236147) | Dilución: 1/1000 | |
| Anticuerpo primario antihistona H3 | Abcam | ab24834 (Lote No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Control de Carga Nuclear; Dilución: 1/2000 |
| Anti-fosfo-histona H2B (Thr129) Anticuerpo primario | Abcam | ab188292 (Lote No. GR211874) | Dilución: 1/1000 |
| Anticuerpo primario antifosfohistona H3 (Ser10) Abcam | ab5176 (lote No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilución: 1/1000 | |
| Biofotómetro D30 | 6133000010 | Eppendorf | |
| (100 x 20 mm) | 30702118 | Eppendorf | |
| 30730011 | Eppendorf | 96 pocillos | |
| 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Burro Anti-Ratón IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Nº de lote C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilución: 1/5000 |
| Burro Anti-Conejo IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Nº de lote C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilución: 1/2500 |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Papel seca extra grueso (papel de filtro) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactosa | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare la solución madre al 20% p/v. |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare una solución madre al 20% c/v. |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare una solución al 50 % p/v. |
| Membranas de transferencia Immobilon-FL | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Acetato de litio dihidratado (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare una solución de 1 M. |
| Carga de | : 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL de glicerol, 1,2 mL de Trizma 0,5M de pH base 6,8, 0,93 g de DL-Ditiotreitol (Sigma-Aldrich D0632) y 2,1 mL de agua desionizada. | ||
| Metanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Célula de electroforesis vertical | BIO-RAD | 1658004 | |
| pipeta multicanal | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Tampón enzimático de restricción 2.1, 10x | Nueva Inglaterra Bio Labs | 102855-152 | |
| Enzima de restricción Nhe I | Nueva Inglaterra Bio Labs | 101228-710 | |
| Qiagen | 129114 | agua sin nucleasas | |
| LI-COR Biosciences | 2800-03 | ||
| OmniTray Cell Culture tratado con tapa estéril, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-sinucleína-GFP | Regalo de A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Regalo de A. Gitler | ||
| Poli(etilenglicol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare una solución al 50% p/v. |
| Mezcla Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | : 0,5 g 0,1% p/p de colorante Ponceau S, 5 mL de ácido acético al 1% v/v (Sigma-Aldrich 320099) y 500 mL de agua desionizada. |
| Fuente de alimentación básica PowerPac | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Rafinosa pentahidratada | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare una solución madre al 10% c/v. |
| DNA | Agilent | 201190 | |
| SD-His | : 20 g de agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g de suplemento de OD He, 6,7 g de levadura nitrogenada base sin aminoácidos (ThermoFisher 291920) y 900 mL de agua desionizada. | ||
| placas SGal-His | : 20 g de agar, 0,77 g de suplemento de OD de He, 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 100 mL de solución de galactosa y 900 mL de agua desionizada. | ||
| carga de dodecil sulfato de sodio | a -20 oC. 6X, mezcla: 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol, 0,93 g de DL-ditiotreitol, 2,1 mL de agua desionizada, 4,7 mL de glicerol y 1,2 mL de base de Trizma 0,5 M, pH 6,8. | ||
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare una solución de 0,2 M. |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare una solución madre al 20% c/v. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mezcla: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) y 900 mL de agua desionizada. | ||
| Tampón de bloqueo | TBS LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Celda de transferencia electroforética semiseca | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Mezcla de tampón | : 22,5 g de glicina, 4,84 g de base Tizma, 400 mL de metanol, 1 g de dodecil sulfato de sodio y 1,6 L de agua desionizada. | ||
| Solución salina tamponada Tris (TBS) | 10X, pH 7,6, Solución: Mezclar 24 g de Trizma base y 88 g de cloruro de sodio (Sigma-Aldrich S7653). Llene hasta 1 L con agua desionizada. | ||
| WT 303 S. cerevisiae | levadura Regalo de J. Extracto de levadura más corto | ||
| Peptona Dextrosa (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
Referencias
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L.
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Reimpresiones y permisos
