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Artículo de método

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

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DOI:

10.3791/59104

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24 de marzo de 2019

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1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe procedimientos experimentales para caracterizar el genoma cambios en los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTM) que ocurre en relación con la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la ELA y la enfermedad de Parkinson en Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Después de la separación de SDS-PAGE, se detectan niveles PTM de las histonas individuales con anticuerpos específicos a la modificación mediante Western blot.

Resumen

Enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP), causan la pérdida de cientos de miles de vidas cada año. Se carecen de opciones de tratamiento efectivo capaces de detener la progresión de la enfermedad. A pesar de los esfuerzos extensos de la secuencia en grandes poblaciones de pacientes, la mayoría de los casos de ELA y PD siguen siendo inexplicable por mutaciones genéticas solo. Mecanismos de epigenética, como la modificación poste-de translación de proteínas histonas, pueden estar involucrados en la progresión y la etiología de la enfermedad neurodegenerativa y conducen a nuevas dianas de intervención farmacéutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro de ALS y PD son costosos y a menudo requieren protocolos experimentales prolongados y laboriosos. Aquí describiremos un enfoque práctico, rápido y rentable para determinar alteraciones del genoma en los niveles de modificación de las histonas mediante Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. Este protocolo permite investigaciones integrales sobre cambios epigenéticos conectadas proteinopatías neurodegenerativas que corroboran los resultados anteriores en sistemas modelo diferentes al mismo tiempo ampliar significativamente nuestro conocimiento de la epigenoma de enfermedades neurodegenerativas.

Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas son devastadoras enfermedades con poca o ninguna opción de tratamiento disponible. Entre estos, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP) son particularmente terrible. Aproximadamente el 90% de casos de ALS y PD se considera esporádico, que ocurre sin antecedentes familiares de la enfermedad, mientras que el resto de los casos se presentan en familias y generalmente está ligado a una mutación gen específico1,2. Curiosamente, dos de estas enfermedades se asocian con proteínas mislocalization y agregación3,4,5,6. Por ejemplo, fundido en el sarcoma (FUS) y proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43) son proteínas de unión de la RNA que mislocalize al citoplasma y agregan en ALS7,8,9,10, 11,12, mientras que α-sinucleína es el componente del principio de agregados proteicos llamados cuerpos de Lewy en PD5,13,14,15.

A pesar de los esfuerzos de asociación amplia del genoma en grandes poblaciones de pacientes, la inmensa mayoría de casos de ALS y PD siendo inexplicable genéticamente. ¿Puede epigenética juega un papel en enfermedades neurodegenerativas? Epigenética comprende cambios en la expresión génica que ocurren sin cambios a subyacente DNA secuencia16. Un principal mecanismo epigenético implica las modificaciones post traslacionales (PTMs) de histona proteínas16. En células eucarióticas, el material genético es tapado en cromatina. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consta de 146 pares de bases del ADN envuelto alrededor de un octámero de histonas, compuesto por cuatro pares de histonas (dos copias de cada de las histonas H2A, H2B, H3 y H4)17. Cada histona tiene una cola N-terminal que sobresale fuera del nucleosoma y puede ser modificada por la adición de grupos químicos diversos, generalmente en residuos de lisina y arginina18. Estos MPa es dinámicas, que significa que se pueden fácilmente agregar y quitaron e incluyen grupos como acetilación, metilación y fosforilación. PTMs controlan la accesibilidad de la DNA a la maquinaria transcripcional y así ayudar a control gene expresión18. Por ejemplo, la acetilación de histonas reduce la fuerza de la interacción electrostática entre la proteína histona muy básico y la columna vertebral carga negativa de ADN, permitiendo que los genes embalados por acetilado histonas sea más accesible y altamente expresó el19. Más recientemente, la notable especificidad biológica del PTMs histonas particulares y sus combinaciones ha conducido a la histona código hipótesis20,21 en que las proteínas que escribir, borrar y leer PTMs histonas actúan en concierto para modulan la expresión génica.

La levadura es un modelo muy útil para el estudio de neurodegeneración. Lo importante, se conservan muchos caminos celulares neuronales de la levadura a los seres humanos22,23,24. Levadura recapitular fenotipos citotoxicidad e inclusiones de proteína a sobreexpresión de FUS, TDP-43 o α-sinucleína22,23,24,25,26. De hecho, se han utilizado modelos de Saccharomyces cerevisiae de la ELA para identificar factores de riesgo genético en los seres humanos27. Además, la levadura overexpressing α-sinucleína humana permitida la caracterización de la red Rsp5 como objetivo druggable mejorar la toxicidad de la α-sinucleína en neuronas28,29.

Aquí, describimos un protocolo explotación de Saccharomyces cerevisiae para detectar genoma histona PTM cambios neurodegenerativos proteinopatías (figura 1). El uso de S. cerevisiae es muy atractivo debido a su facilidad de uso, bajo costo y la velocidad en comparación con otros modelos in vitro y animales de neurodegeneración. Aprovechamiento previamente desarrollado ELA y PD modelos22,23,25,26, hemos overexpressed humanos FUS, TDP-43 y α-sinucleína en levadura y descubierto distintos histona PTM cambios que ocurren en conexión con cada proteinopathy30. El protocolo que se describe aquí puede completarse en menos de dos semanas de la transformación para análisis de datos.

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Protocolo

1. transformación de S. cerevisiae con neurodegenerativas proteína asociada a la proteinopathy construcciones

  1. Crecer la levadura 303 tipo salvaje (WT) en caldo de dextrosa (YPD) de peptona de extracto de levadura durante la noche con agitación (200 rpm) a 30 ° C.
  2. Después 12−16 h de crecimiento, diluir la levadura a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0.25 con YPD. Como 10 mL de cultivos líquidos de levadura se necesitarán para cada transformación, preparar 50 mL de cultivos líquidos de levadura para cinco transformaciones correspondientes a FUS, TDP-43, a-sinucleína y vector único (ccdB) construcciones, así como una transformación del control negativo sin ADN.
  3. Crecer levaduras con agitación a 30 ° C hasta que se alcance un OD600 entre 0,60 y 0,80. Esto generalmente toma h 4−6.
  4. Treinta minutos antes de que el crecimiento de la levadura es completa, alinear plásmido construcciones.
    Nota: Las construcciones de plásmido utilizadas aquí deben integrarse directamente en el genoma, y por lo tanto, la linealización es requerida antes de transformación.
    1. Calcular el volumen de stock de plásmido que asciende a 1 μg. restar este volumen de 44 μL para calcular la cantidad de nucleasa libre H2O es necesario.
    2. Añadir nucleasa libre H2O, 5 μl de buffer de enzima de la restricción de x 10 (Tabla de materiales), 1 μl de enzima de la restricción de NheI (Tabla de materiales) y la cantidad apropiada de plásmido (calculado en paso 1.4.1) a un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. El plásmido es transformación lineal y lista para.
  5. Después de levadura cultura alcanza una OD600 de 0.6-0.8, cosecha de células en un tubo cónico de 50 mL y un spin abajo a 850 x g a 4 ° C por 3 minutos descartar sobrenadante.
  6. Lavar el precipitado de células en 10 mL de H2O y centrifugue a 850 x g a 4 ° C durante 3 minutos descartar sobrenadante estéril. Repetir 3 veces para un total de cuatro lavados.
  7. Al comienzo del tercer lavado, descongelar y cocer 10 μl de esperma de salmón DNA por la reacción de transformación de 5 min en un bloque de la calefacción.
  8. Resuspender el precipitado de células en 100 μl de dH2O por transformación y dividido en un número apropiado de tubos de microcentrífuga. De las cinco transformaciones, Resuspender el precipitado en 500 μl de dH2O y dividir uniformemente en cinco tubos de microcentrífuga separado.
  9. Centrifugar durante 5 min a 850 x g a temperatura ambiente (RT) y retire toda el agua restante.
  10. En el siguiente orden, agregar 50 μl de estéril de H2O, 240 μl de 50% de polietilenglicol (PEG), 36 μl de 1 M LiAc, 10 μl de DNA de esperma de salmón, 20 μl de ADN de plásmido lineal (o agua libre de nucleasa para ninguna transformación de control de ADN). Mezclar bien después de cada adición y vortex brevemente después de que se han agregado todos los componentes de transformación.
  11. Incubar las reacciones de transformación a 42 ° C por 20 min.
    Nota: Llevar a cabo la incubación en baño de agua para control de temperatura más constante.
  12. Centrifugue a 470 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos descartar sobrenadante y resuspender cada precipitado de células en 200 μL de estéril de H2O.
  13. Placa de suspensión de levadura en las placas de medios selectivos y con granos de balanceo o esparcidor. Incubar las placas durante 2−3 días a 30 ° C.
    Nota: Define sintético (SD)-sus placas se utilizan para la plásmidos descrita aquí.

2. examina la supresión del crecimiento de colonias y almacenamiento en las poblaciones de glicerol

  1. Inocular las colonias individuales de las placas de la transformación en 5 mL de medio selectivo suplementado con 2% rafinosa. Crecer en un agitador a 30 ° C durante la noche. Seleccione por lo menos 12 colonias por transformación.
    Nota: Se espera que hay colonias en la placa de control de transformación "no ADN".
  2. Esterilizar el pin-frogger con etanol, seguida de llamas.
  3. Para cada cultivo, alícuota 100 μl de suspensión celular saturado en la primera fila de una placa de 96 pocillos. Añadir 200 μL de estéril de H2O en todos los pocillos de las columnas adyacentes bien. Para diluciones seriadas de 1:5, añada 50 μl de la primera columna a la columna adyacente detrás con pipeta multicanal. Mezclar bien mediante pipeteo. Luego añada 50 μl de la segunda columna a la tercera columna y mezclar mediante pipeteo. Repetir este proceso para el resto de la placa.
  4. Levadura de la placa colocando el frogger en una placa de 96 pocillos y luego sellado presionando suavemente y uniformemente sobre placas de medios selectivos con y sin galactosa. Incubar a 30 ° C durante 2−3 días.
    Nota: Las placas SD-su y su SGal se utilizan para la plásmidos descrita aquí.
  5. Para FUS, TDP-43 y a-sinucleína transformaciones, identificar la Colonia mostrando la mayoría supresión de crecimiento en presencia de galactosa. Seleccione esta colonia de la placa de su SD e inocular en 10 mL de medio selectivo suplementado con 2% rafinosa para el crecimiento durante la noche. Para el control de vectores, escoge una colonia no mostrando ninguna supresión de crecimiento en presencia de galactosa.
  6. Para preparar las acciones de glicerol, combinan 0,5 mL del cultivo líquido saturado con 0,5 mL de glicerol al 50%. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo y congelar a-80 ° C.
    Nota: Las existencias de glicerol pueden conservarse hasta un año a-80 ° C.

3. la sobreexpresión de proteinopathy neurodegenerativas asociadas proteínas en S. cerevisiae

  1. De las existencias de glicerol helados, levadura vuelve a raya en histidina, medios selectivos de agar de glucosa de 2% placas e incuban a 30 ° C 2−3 días.
  2. Inocular las colonias individuales de cada uno de los modelos de sobreexpresión y control en 5 mL de medio líquido selectivo histidina suplementado con 2% rafinosa. Crecer con agitación (200 rpm) a 30 ° C durante la noche.
  3. Crecen 100 mL del cultivo líquido para cada uno de los modelos de sobreexpresión y controles (FUS, TDP-43 y vector control; a-sinucleína y vector control).
    1. Preparar 100 mL de cultivo en medios selectivos suplementados con 2% de galactosa.
    2. Mida OD600 de culturas durante la noche y calcular la cantidad de la cultura necesaria para representar las culturas de la sobreexpresión de una partida de OD600 de 0,3. Por lo general, las culturas durante la noche alcanzará un OD600 de 0.9−10, que requieren unos 5 mL de cultivo durante la noche para empezar a 100 mL de cultivo fresco.
    3. Inducir la sobreexpresión de la proteína por cultivo de levadura en medios de galactosa (ver paso 3.3.1) 5 h (FUS y TDP-43) o 8 h (a-sinucleína) con agitación a 30 ° C.
  4. Mida OD600 de cada cultura en el final del período de inducción. Estandarizar todos los recuentos de células para el valor más bajo de600 OD. Cosechar el cultivo en tubos de 50 mL por centrifugación a 850 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    Nota: Si los valores de OD600 medidos al final de la inducción son 0.654 y 0.984, respectivamente, por 100 de la cultura de al-sinucleína y 100 mL de cultivo control, cosecha 95 mL de la cultura de a-sinucleína y mL 67,1 de la cultura de control.
  5. Resuspender el precipitado en 1 mL de estéril dH2O para cada 10 mL de cultivo crecido. Pellets de Split uniformemente por tomar 1 mL de resuspensión de células en los tubos de microcentrífuga. Por ejemplo, si a partir de 100 mL de la cultura, Resuspender el precipitado en 10 mL de estéril dH2O y dividirlo en 10 tubos de microcentrífuga.
  6. Centrifugue a 850 x g durante 5 min a 4 ° C, luego retire el sobrenadante. Snap freeze pellets de células en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
    Nota: Gránulos de la célula pueden almacenarse a-80 ° C hasta por un año.

4. la célula lysis y western blot para detectar modificaciones post-traduccionales de las histonas

  1. Lisis de la célula
    1. Descongele la pelotillas de células de levadura en el hielo y resuspender el pellet celular en 100 μl de dH2O.
    2. A la resuspensión de células, añadir 300 μL de NaOH M 0.2 y 20 μl de 2-Mercaptoetanol. Resuspender mediante pipeteo arriba y abajo.
    3. Incubar las células en hielo durante 10 minutos y luego centrifugar a 3.200 x g en una centrífuga de mesa para 30 s en RT. descartar sobrenadante.
    4. Resuspender el precipitado de células en 100 μl de 1 x carga de tinte y hervir durante 10 minutos en un bloque de la calefacción.
      Nota: La receta para 6 x carga colorante puede encontrarse en la Tabla de materiales.
  2. Sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis y membrana de transferencia
    1. Preparar el gel cámara colocando dos geles en un gel de soporte y relleno cámara interior a la cima con funcionamiento tampón y llenado de la cámara exterior a la marca de línea de dos geles.
    2. Carga 15 μl de la muestra del paso 4.1.4 por pocillo en un gel de poliacrilamida al de 12% 10-bien. Por el carril de la escalera de proteína, carga 5 μl.
    3. Ejecutar gel para aproximadamente 45 minutos a 150 V, o hasta que la carga frontal de tinte alcanza la parte inferior del gel.
    4. Mientras el gel está funcionando, preparar para la transferencia de membrana empapando almohadillas de fibra (dos por gel) en tampón de transferencia (Tabla de materiales) y remojo membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro en metanol. Enjuagar la membrana en tampón de transferencia antes de la transferencia.
      Nota: La membrana PVDF debe cortarse al tamaño del gel y utilizar una membrana PVDF para cada gel se transfiere.
    5. Montar en célula de aparatos de transferencia semiseco, una transferencia 'sandwich': del electrodo inferior, coloque fibras (1) presoaked, membrana PVDF (2) presoaked y enjuagada, (3) gel de paso 4.2.3 y (4) una segunda almohadilla de fibra presoaked.
      Nota: Asegúrese de que evitar burbujas de aire en la transferencia 'sandwich'. Suavemente el rodillo 'sandwich' con pipeta serológica para eliminar burbujas. Una vez que el gel se ha colocado encima de la membrana PDVF, asegúrese de no moverlo.
    6. Efectuar transferencia de proteínas mediante el establecimiento de alimentación a 150 mA durante 1 hora (para un ' sandwich').
  3. Detección de la histona PTMs con anticuerpos específicos de modificación
    1. Quitar la membrana de aparatos de transferencia. Enjuague brevemente con dH2O.
      1. Opcionalmente, verificar a transferencia de las proteínas con colorante Ponceau S vertiendo suficiente colorante Ponceau S para cubrir la membrana en una pequeña caja de plástico e incubando a temperatura ambiente con agitación suave para 30−60 s. Ponceau-S quitar la mancha y enjuague con dH2O hasta que la mancha de fondo desaparece y bandas de proteína son visibles a simple vista. Continúan enjuague con dH2O hasta que se quita toda mancha de la membrana.
    2. Bloquear la membrana incubando blot durante 1 h a temperatura ambiente con el suave balanceo con tampón salino (TBS) bloqueo tampón tris (Tabla de materiales) en una pequeña caja de tinción. Use suficiente solución amortiguadora de bloqueo para cubrir blot.
      Nota: Tenga cuidado de colocar membrana vertical en la caja de tinción para que el lado de la membrana en que mentira de proteínas no es hacia abajo.
    3. Incubar la mancha blanca /negra en la caja de tinción durante la noche con un anticuerpo de específico de modificación de histonas reactiva hacia levadura a 4 ° C. Diluir el anticuerpo en solución amortiguadora de bloqueo TBS según especificaciones del fabricante. También incluyen un control de la carga nuclear adecuada, como anti-total H3 en una especie de host diferente de los anticuerpos específicos de modificación. Por ejemplo, si sondeo para H3S10ph con un anticuerpo anti-H3S10ph en el conejo, utiliza un anticuerpo de anti-total H3 en ratón como control de carga. Repita esto para cada mancha según sea necesario.
      Nota: Las diluciones del anticuerpo pueden ser reutilizadas para un total de tres veces dentro de un mes. Almacenar a 4 ° C.
    4. Lavar la membrana 4 x en casa-hecha TBS + 0.1% polisorbato 20 (TBST) por 5 min con mecedora a TA.
    5. Incubar blot con anticuerpos fluorescentes secundarios en diluciones especificados por el fabricante (burro anti-conejo 680 y anti-ratón burro) por 1 h a TA.
      Nota: Fluorescentes anticuerpos secundarios deben ser protegidos de la luz durante el almacenamiento y uso. Llevar a cabo la incubación en cajas de plástico oscuros o cubrir con papel de aluminio.
    6. Lavar la membrana 4 x con TBST por 5 min y lavado con TBS durante 5 minutos mientras balanceo a TA.
    7. Visualize borrón en un Western blot fluorescente sistema para 2 minutos de imagen visualizar el anti-conejo 680 y secundaria anticuerpos anti-ratón 800 en el 800 nm y los 700 nm canales, respectivamente.
      Nota: Se replica independientemente se realizan a partir de la sección 1. Es necesario verificar que la respuesta del anticuerpo de señal está dentro del rango sobre el cual la respuesta de la señal es lineal para la interpretación de los datos adecuados en estos experimentos.

5. estadísticas y análisis de datos

  1. Abre la imagen de la mancha blanca /negra en un software de proyección de imagen (Tabla de materiales). Adquirir la materia prima densidad de muestras de bandas específicas de modificación en el vector control, TDP-43 y FUS (o control de vectores y a-sinucleína), dibujando un rectángulo que enmarca la banda en el modo de análisis.
  2. Repita el paso 5.1 para bandas de control de carga.
    Nota: Habrá una carga control de bandas y una modificación específica en cada muestra.
  3. Calcular la densidad relativa de las bandas específicas de modificación dividiendo cada banda por la densidad de la banda correspondiente en la muestra de control de vectores. Esto normaliza los datos para el control de vectores.
  4. Calcular la densidad relativa de la carga banda control dividiendo cada banda por la densidad de la carga correspondiente banda control en la muestra de control de vectores.
  5. Calcular la densidad relativa ajustada de cada banda dividiendo la densidad relativa de la banda específica de modificación sobre la densidad relativa de la carga de la banda de control para cada muestra. Ahora, los datos pueden visualizarse en forma de histograma.
    Nota: Para facilitar el proceso, pasos 5.3 – 5.5 pueden hacerse en una hoja de cálculo (Archivo suplementario).
  6. Después de múltiples repeticiones independientes, T-pruebas de ejecución de Welch entre las muestras de control de dos y el proteinopathy apropiado del modelo (control versus FUS, control versus TDP-43 y control frente a-sinucleína) con p = 0.05 como el límite de significación .

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Resultados

Para ilustrar este método, tomaremos ventaja de resultados recientemente publicados30. FUS humano WT y TDP-43 se sobreexpresa de 5 horas, mientras que WT α-sinucleína se sobreexpresa de 8 h. Una construcción ccdB fue utilizada como un control negativo de vector. La figura 2 muestra la supresión del crecimiento en cultivos sólidos y líquidos. La levadura fue cosechada como se describe y Western Blot con anticuerpos específicos de modifi...

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Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona una manera sencilla, conveniente y rentable de la categorización de cambios PTM genoma histona con neurodegenerativas proteinopatías. Mientras que hay otros modelos de ALS y PD, como en vitro líneas celulares humanas y murinas modelos32, restos de S. cerevisiae atractivos debido a su facilidad de uso. Por ejemplo, modelos de levadura no requieren el uso de una capucha estéril, ni necesitan el intensivo entrenamiento va junto con el trabajo d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf y Sadiqa Taasen ayuda técnica. Estamos muy agradecidos con el Prof. James Shorter por la generosa provisión de reactivos y ayuda intelectual en el diseño de los experimentos de afinación de sacarosa. Plásmidos de la levadura fueron una generosa donación de la Prof. Aaron Gitler (incluyendo 303Gal-FUS; Plásmido Addgene # 29614). Brooklyn College y la avanzada ciencia investigación centro (CUNY) así como un NIH NINDS avanzado Postdoctoral transición Premio (K22NS09131401) admite M.P.T.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
-Su suplemento de ODClontech630415
10x Running BufferMix: 141,65 g de glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodecil sulfato de sodio (Sigma-Aldrich L3771) y 1 L de agua desionizada, pH 8,8.
12% Geles de poliacrilamidaBIO-RAD456-1041
2-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148
Antiacetil-histona H3 (Lys14) Anticuerpo primarioMilliporeSigma07-353 (Lote Nº 2762291)Dilución: 1/1000
Antiacetil-histona H4 (Lys 16) Anticuerpo primarioAbcamab109463 (Lote Nº. GR187780)Dilución: 1/2000
Anticuerpo primario antiacetil-histona H4 (Lys12)Abcamab46983 (Lote No. GR71882)Dilución: 1/5000
Anticuerpo primario anti-dimetil-histona H3 (Lys36) Abcamab9049 (Lote No. GR266894, GR3236147)Dilución: 1/1000
Anticuerpo primario antihistona H3Abcamab24834 (Lote No. GR236539, GR174196, GR3194335)Control de Carga Nuclear; Dilución: 1/2000
Anti-fosfo-histona H2B (Thr129) Anticuerpo primarioAbcamab188292 (Lote No. GR211874)Dilución: 1/1000
Anticuerpo primario antifosfohistona H3 (Ser10) Abcamab5176 (lote No. GR264582, GR192662, GR3217296)Dilución: 1/1000
Biofotómetro D306133000010Eppendorf
(100 x 20 mm)30702118Eppendorf
30730011Eppendorf96 pocillos
5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Burro Anti-Ratón IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (Nº de lote C60301-05, C61116-02, C80108-05)Dilución: 1/5000
Burro Anti-Conejo IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (Nº de lote C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Dilución: 1/2500
EtanolSigma-AldrichE7023
Papel seca extra grueso (papel de filtro)BIO-RAD1703968
GalactosaSigma-AldrichG0750Prepare la solución madre al 20% p/v.
GlucosaSigma-AldrichG8270Prepare una solución madre al 20% c/v.
GlicerolSigma-AldrichG5516Prepare una solución al 50 % p/v.
Membranas de transferencia Immobilon-FLMilliporeSigmaIPFL00010
Acetato de litio dihidratado (LiAc)Sigma-AldrichL4158Prepare una solución de 1 M.
Carga de: 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL de glicerol, 1,2 mL de Trizma 0,5M de pH base 6,8, 0,93 g de DL-Ditiotreitol (Sigma-Aldrich D0632) y 2,1 mL de agua desionizada.
MetanolThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra Célula de electroforesis verticalBIO-RAD1658004
pipeta multicanalEppendorf2231300045
NEB Tampón enzimático de restricción 2.1, 10xNueva Inglaterra Bio Labs102855-152
Enzima de restricción Nhe INueva Inglaterra Bio Labs101228-710
Qiagen129114agua sin nucleasas
LI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Cell Culture tratado con tapa estéril, PS (86 x 128 mm)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-sinucleína-GFPRegalo de A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43Regalo de A. Gitler
Poli(etilenglicol) (PEG)Sigma-AldrichP4338Prepare una solución al 50% p/v.
Mezcla Ponceau S StainSigma-AldrichP3504: 0,5 g 0,1% p/p de colorante Ponceau S, 5 mL de ácido acético al 1% v/v (Sigma-Aldrich 320099) y 500 mL de agua desionizada.
Fuente de alimentación básica PowerPacBIO-RAD164-5050
Rafinosa pentahidratadaSigma-AldrichR7630Prepare una solución madre al 10% c/v.
DNAAgilent201190
SD-His: 20 g de agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g de suplemento de OD He, 6,7 g de levadura nitrogenada base sin aminoácidos (ThermoFisher 291920) y 900 mL de agua desionizada.
placas SGal-His: 20 g de agar, 0,77 g de suplemento de OD de He, 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 100 mL de solución de galactosa y 900 mL de agua desionizada.
carga de dodecil sulfato de sodioa -20 oC. 6X, mezcla: 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol, 0,93 g de DL-ditiotreitol, 2,1 mL de agua desionizada, 4,7 mL de glicerol y 1,2 mL de base de Trizma 0,5 M, pH 6,8.
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich221465Prepare una solución de 0,2 M.
SacarosaSigma-Aldrich84097Prepare una solución madre al 20% c/v.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)Mezcla: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) y 900 mL de agua desionizada.
Tampón de bloqueoTBS LI-COR927-5000
Trans-Blot SD Celda de transferencia electroforética semisecaBIO-RAD170-3940
Mezcla de tampón: 22,5 g de glicina, 4,84 g de base Tizma, 400 mL de metanol, 1 g de dodecil sulfato de sodio y 1,6 L de agua desionizada.
Solución salina tamponada Tris (TBS)10X, pH 7,6, Solución: Mezclar 24 g de Trizma base y 88 g de cloruro de sodio (Sigma-Aldrich S7653). Llene hasta 1 L con agua desionizada.
WT 303 S. cerevisiaelevadura Regalo de J. Extracto de levadura más corto
Peptona Dextrosa (YPD)Sigma-AldrichY1375
Plato de cultivo celular Placa de cultivo celular , centrífuga de la mezcla de colorantes Sistema de imagen Odyssey Fc de Mezcla de placas SD-His DNA Mezcla de Almacenamiento tampón de de transferencia

Referencias

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