Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.
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Artículo de método
Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros
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Resumen
Resumen
Hay gran interés en el estudio de las microalgas para aplicaciones de ingeniería tales como la producción de biocombustibles, productos de alto valor y para el tratamiento de residuos. Medida más nuevos esfuerzos de investigación a escala de laboratorio, hay una necesidad de métodos rentables para el cultivo de microalgas de forma reproducible. Aquí, nos comunicamos un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores de escala de laboratorio y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. También se incluyen instrucciones sobre cómo configurar el sistema de fotobiorreactor. Aunque los organismos ejemplo son especies de Chlorella y Auxenochlorella, se puede adaptar este sistema para cultivar una amplia gama de microalgas, incluyendo co-cultivos de algas con las especies de algas no. Culturas comunes se cultivan primero en botellas para producir inóculo para el sistema del fotobiorreactor. Inóculo de algas se concentra y transferido a fotobiorreactores para el cultivo en lotes. Las muestras se recogen diariamente de las lecturas de densidad óptica. Al final de la cultura de la hornada, las células se cosechan por centrífuga, lavado y liofilizado para obtener una concentración de peso seco final. La concentración de peso seco final se utiliza para crear una correlación entre la densidad óptica y la concentración de peso seco. Un método modificado de Folch se utiliza posteriormente para extraer los lípidos totales de la biomasa liofilizada y el extracto es analizado por su contenido de lípido neutral usando un análisis de la microplaca. Este ensayo ha sido publicado anteriormente pero pasos de protocolo se incluyeron aquí para destacar los pasos críticos en el procedimiento donde se producen frecuentemente errores. El sistema de biorreactor descrito aquí llena un nicho entre cultivo frasco simple y biorreactores comerciales totalmente controlado. Incluso con sólo 3-4 biológicos repeticiones por tratamiento, nuestro acercamiento al cultivo de algas conduce a desviaciones de estándar ajustadas en los ensayos de crecimiento y de los lípidos.
Introducción
El uso de microalgas en ingeniería y biotecnología ha atraído gran interés en los últimos años. Microalgas se están estudiando para el uso en aguas residuales tratamiento1,2,3,4, biocombustibles producción5,6,7,8y el producción de nutracéuticos y otros productos de alto valor9,10. Las algas también se están modificando genéticamente a mayores tasas en un esfuerzo por mejorar su idoneidad para aplicaciones ingeniería específica11,12 En consecuencia, hay gran interés en la experimentación con organismos industrialmente relevantes en entornos controlados. El propósito de este método es para comunicar un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en un entorno de laboratorio controlado y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. Mejorar el crecimiento de las tasas y el contenido de lípido neutral de microalgas han sido identificados como dos cuellos de botella claves hacia la comercialización de biocombustibles de algas13.
Una amplia gama de enfoques se han utilizado a las algas de la cultura para los propósitos experimentales. En general, estos enfoques se pueden dividir entre cultivo al aire libre a gran escala y pequeña escala cultivo interior. Cultivo al aire libre en estanques abiertos y en fotobiorreactores es apropiado para la experimentación a la intensificación de procesos que ya han sido probados a escala de laboratorio (por ejemplo, para probar a escala de una nueva cepa de alta de lípidos de algas)14. Sin embargo, el cultivo en pequeña escala interior es apropiado al desarrollo de cepas de algas nuevos o mejorados o realizar experimentos dirigidos a comprender los mecanismos biológicos. En estos últimos casos, es necesaria un alto grado de control experimental para provocar cambios sutiles en el comportamiento biológico. Para ello, cultivos axénicos a menudo se requieren para reducir al mínimo los complejos factores bióticos asociados con otros organismos (e.g. bacterias, otras algas) que inevitablemente crecen en sistemas al aire libre a gran escala. Incluso al estudiar las interacciones entre algas y otros organismos, hemos encontrado que el uso de condiciones experimentales altamente controladas es útil al examinar el intercambio molecular entre los organismos15,16,17.
Dentro de la categoría de cultivo de algas interiores en pequeña escala, se han utilizado una variedad de enfoques. Quizás el método más común es crecer algas en matraces de Erlenmeyer sobre una mesa coctelera debajo de un banco de luz18,19. Intercambio de oxígeno y CO2 lleva a cabo por difusión pasiva a través de un tapón de espuma en la parte superior del frasco. Algunos investigadores han mejorado este montaje una aireación activa de los matraces20. Otro método es cultivar algas en botellas, mezcladas por barra de agitación y aireación activa. A pesar de su sencillez, hemos encontrado que el uso de frascos y botellas a menudo conduce a resultados inconsistentes entre los distintos recipientes biológicos. Probablemente esto es debido a los efectos de la posición - posiciones reciben diferentes cantidades de luz, que también afectan las temperaturas del interior del reactor. Rotación diaria de reactores a nuevas posiciones puede ayudar pero no solucionar el problema porque ciertas etapas de crecimiento de las algas (por ejemplo, temprano exponencial) son más sensibles a efectos posicionales que otros (p. ej., fase de registro).
En el lado opuesto del espectro de la sofisticación tecnológica son fotobiorreactores comercial totalmente controlado. Estos sistemas continuamente monitorea y regula las condiciones en el reactor para optimizar el crecimiento de algas. Tienen iluminación programable, control de temperatura en tiempo real y control del pH. Por desgracia, son caros y por lo general cuestan varios miles de dólares por el reactor. Más revistas científicas y de ingeniería requieren replicación biológica de resultados, lo que requeriría la compra de varios Biorreactores. Aquí os presentamos un sistema de reactor de columna de burbujas que une la brecha entre el simple (matraz) y sofisticado (biorreactor totalmente controlado) se acerca para el cultivo de algas de escala de laboratorio. Columnas de burbujas utilizan burbujas de gas de levantamiento para facilitar el intercambio de gases y mezcla del reactor. Este enfoque proporciona cierto grado de control sobre la iluminación y la temperatura pero lo hace de una manera rentable. Por otra parte, hemos encontrado este sistema para producir resultados muy consistentes entre los distintos recipientes biológicos, reduciendo el número de repeticiones biológicos necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos en comparación con el método de frasco o botella. También hemos utilizado este sistema para cultivar con éxito mezclas de algas y bacterias21. Además de cultivo de algas, describiremos un procedimiento para medir el contenido de lípidos neutros en las algas cultivadas. Este último método ha sido publicado en otro lugar22, pero incluimos aquí el procedimiento para proporcionar instrucciones paso a paso sobre cómo utilizar con éxito.
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Protocolo
1. configuración de fotobiorreactores de columna de burbuja
- Construir un conjunto de tapas ventiladas de las tapas de plástico que viene con las botellas de vidrio de 1 L y tubos de hibridación (véase figura 1 esquema y fotos). La construcción de las tapas para el humidificador, trampa, cada aire ascensor fotobiorreactor y cada reactor botella de mezcla.
- ¼" agujeros en la tapa: 2 agujeros son necesarios para las tapas de bioreactor y el humidificador; 3 agujeros se necesitan para la trampa de la mezcla.
- Deslice un ¼" junta tórica sobre la rosca de un 1/8" panel montaje tipo Luer y deslice este en el ¼" agujero perforado en la tapa (figura 1A).
- Deslice un segundo ¼" junta tórica sobre la rosca para que la tapa se intercala entre las dos juntas tóricas. Deslice una tuerca en la rosca y apriete para fijar el panel montaje Luer.
- Coloque los anillos de cerradura en expuesto proyectando Luer macho de la tapa. Repita los pasos 1.1.2-1.1.4 para cada agujero en la tapa.
- Para las tapas que serán utilizadas en reactores de columna y la botella de burbuja, 1/8" Luer hembra a púa a 1.5" piezas de 1/8" tubería de PVC de identificación. Adjunte a cada una de las conexiones expuestas de Luer masculinas en la tapa.
- Conecte una válvula de retención (señalando lejos de la tapa) en el extremo libre de uno de la 1/8" piezas.
Nota: Esto servirá como el puerto de salida para el biorreactor. - Conecte un Luer masculino a barb a la segunda pieza de la proyección de la tapa de la tubería de 1/8". Haga clic en el anillo de cierre giratorio en su lugar y fijar un filtro de aire de 0,2 mm a esto.
Nota: Esto servirá como puerto de entrada para el reactor.
Figura 1. Esquema y fotos para la construcción de biorreactores. (A) esquema para construcción del biorreactor tapas (B) foto de la tapa del biorreactor montado y (C) foto de la tapa armada utilizada para el humidificador. Tenga en cuenta que los accesorios de humidificador deben ser cubiertos en silicona a prueba de agua para asegurar un sello hermético con la tapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Montar el sistema de suministro de aire (ver figura 2A y 2B para un esquema y foto).
- Acople 1/8" rosca NPT a púa a las entradas y salidas en la parte posterior de cada rotámetro.
Nota: 200-2.500 cm3/min rotámetros para modulación de presión de aire aguas arriba del humidificador, son de 100-1.000 cm3/min rotámetros para botella reactores, 50-500 cm3/min rotámetros son biorreactores de levantamiento del aire, y 5-50 cm3/ rotemeters min son para regulación del flujo de CO2 . Se recomienda para rotámetros de montaje a una superficie fija (por ejemplo, lámina de plástico) para que caiga durante la operación. - Apague la fuente de aire comprimido, luego conecte ¼" ID PVC tubería flexible a la fuente de aire comprimido con una abrazadera. Bajar el diámetro de la manguera de 1/8" tubería flexible de PVC de identificación usando un ¼" hembra para conexión de lengüeta y una 1/8" macho para conexión de lengüeta.
- Conecte el extremo libre de la tubería de 1/8" ID a la entrada de un rotámetro de 200-2.500 cm3/min.
Nota: La salida de este rotámetro alimentarán la botella del humidificador por 1/8" tubería de ID. - Conecte el 1/8" tubo una entrada a una tapa con ventilación (uso un Luer hembra a lengüeta de montaje para hacer la conexión). Luego conecte un segundo pedazo de 1/8" tubería en el interior del montaje del panel apropiado.
Nota: Esta pieza se cuelgue en el humidificador y aire burbuja a través del agua. - Acople 1/8" Luer hembra lengüeta conexiones en cada extremo de un pedazo de 1/8" tubería ID y utilizar esta pieza para conectar la salida del humidificador a la entrada de la trampa de la mezcla.
- De la misma manera como 1.2.5, conecte la salida del regulador de CO2 para un segundo puerto en la trampa de la mezcla.
- Construir un colector con 1/8" tubería y 1/8" barb multipuerto (ver figura 2 C) para alimentación de aire a los bancos de rotámetro.
Nota: Se usará estos medidores de caudal para abastecer los Biorreactores. Evitar la construcción de más de 6 medidores de caudal en serie. En su lugar, utilizar bancos paralelos de rotámetros para ampliar el sistema. Asegúrese de que la demanda total para todos los reactores está a menos de 2.500 cm3/min (o más será necesario un rotámetro más grande aguas arriba del humidificador). - Conectar la salida (3rd puerto) de la trampa de mezcla a los bancos de rotámetro recién construida usando 1/8" tubería y un 1/8" hembra a conector Luer.
- Conectar suficientemente largo 1/8" tubería a las salidas de cada rotámetro en el Banco de rotámetro para suministrar aire a los Biorreactores. Etiquetar los extremos de la tubería, así como los medidores de caudal en el Banco.
- Aplicar silicona a prueba de agua en todos los puertos en el humidificador y mezcla tapas trampa para asegurar que sean herméticas.
- Acople 1/8" rosca NPT a púa a las entradas y salidas en la parte posterior de cada rotámetro.
Figura 2. Esquema y fotos para el montaje de sistema de columna de burbuja. (A) esquema de la foto (B) del sistema de aireación del humidificador, mezcla de trampa y el Banco de rotámetro y (C) foto de los colectores utilizados para conectar los bancos de rotámetro juntos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Configurar los tanques de pescados, remover las placas y las luces (figura 3).
PRECAUCIÓN: Este sistema requiere un gran número de salidas y suficiente capacidad de circuito para soportar todos los componentes. Evitar ensartando varias regletas y extensiones en forma de cadena de Margarita porque es un peligro eléctrico. Utilización de tipo GFI y regletas es muy animado debido a la presencia de agua en el sistema.- Organizar los agitadores magnéticos de bajo perfil sobre una superficie plana que es lo suficientemente fuerte como para soportar el peso de peceras llenas de agua.
- Lugar de madera o plásticos bloques pequeños (que son ligeramente más altos que las placas de agitación) alrededor del perímetro de las placas de agitación para soportar el peso de los tanques de peces.
PRECAUCIÓN: Evite colocar los tanques de pescado directamente sobre las placas de agitación como el peso triture. - Los tanques de peces sobre las placas de agitación y bloques de apoyo y llenar los tanques con agua.
- Cortar un trozo de una lámina de plástico rígido para caber encima de la pecera como una tapa. Corte orificios en esta cubierta se deslice hacia adentro y hacia afuera los tubos de hibridación. También cortar un agujero para el calentador para pecera.
- Organizar los bancos de luz fluorescentes junto a la pecera para proporcionar iluminación horizontal de los Biorreactores. Conecte el Banco de luz a un temporizador de luz para programar un ciclo de día/noche.
Figura 3. Sistema esquemático de los Biorreactores de botella (izquierdos) y los fotobiorreactores de columna de burbuja (derecha). Esta figura ha sido modificada de Higgins et al. 17. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. preparación del inóculo de microalgas
- Obtener inóculo de microalgas de una cultura crio-preservado, plateada o líquida.
Nota: Se recomienda platear organismos criopreservados antes de su uso como inóculo para garantizar que las células son viables y que la cultura resultante es axénico. Medio de agar (por ej., ATCC #5 esporulando agar)21 es un medio rico que funciona bien para revivir especies de Chlorella y Auxenochlorella de cryo-almacenamiento de información. - Preparar el 2.4 L de medio mineral que es apropiado para las especies de microalgas particular.
Nota: Por ejemplo N8 medio23 especies de Chlorella, N8-NH4 medio21 especies de Auxenochlorella. Uso de un medio de cultivo adecuado para la cepa de algas es uno de los pasos más importantes para asegurar el crecimiento de algas robustos. - Alícuota 2.4 L de medio mineral igualmente en tres botellas de vidrio de 1 L, agregar remover barras a cada botella y montar las tapas de ventilación (figura 1) para cada botella. Comprobar que el tubo de aireación es en el lado de entrada y cada botella tiene una barra de agitación.
- Autoclave de las botellas de stock mediante una esterilización líquida ciclo (121 ° C) por 30 minutos Autoclave 100 mL de agua desionizada (dH2O) y algunos tubos de 1,5 mL a la vez, que más tarde será utilizada para la galjanoplastia. Permitir que el medio fresco durante la noche. También puede enfriar el reactor a la temperatura ambiente y luego airear 2 h antes de la inoculación.
- En un seguridad de la biotecnología gabinete (BSC), inocular microalgas de una placa o axénico cultivo líquido en las botellas de stock. Utilizar técnica estéril para mantener cultivos axénicos en los siguientes pasos.
- Añadir 20 mL de autoclave dH2O a un tubo de centrífuga estéril 50 mL. Utilizar un asa desechable estéril de 10 μL para elegir varias colonias individuales de la placa en el paso 2.1. El bucle de la inmersión en el tubo de 50 mL y lavar las células de las algas en los 20 mL de autoclave dH2O. Agitar el tubo de 50 mL para hacer una solución homogénea de microalgas.
- Pipeta de 6 mL de solución de microalgas en cada botella de stock con una pipeta serológica estéril de 10 mL. Agitar la botella para mezclar homogéneamente las microalgas en el medio.
- Utilice una pipeta serológica estéril de 2 mL para extraer muestras de 1 mL de cada botella de stock y transferencia en tubos de 1,5 mL estéril.
Nota: Micropipetas no se recomiendan para este paso debido al riesgo de contaminación. Apriete las tapas de ventilación en las botellas de stock. - Coloque las botellas de stock en placas de agitación (~ 150 rpm) y ajustar el caudal de aire, CO2y niveles de iluminación según convenga para la especie. Gire a la posición de la botella de stock cada día.
- Diluir las muestras 1 mL obtenidas en el paso 2.6 (100-fold dilución en agua estéril generalmente funciona bien) y coloque la placa en un medio de agar rico.
Nota: Estas placas pueden utilizarse para comprobar casos de contaminación, así como servir como fuente de inóculo de algas futuro para más experimentos. - Tomar muestras de las botellas (en el BSC) cada dos días para comprobar el crecimiento de microalgas.
Coloque las muestras en una microplaca de 96 pozos en triplicado (200 μL) y medir la densidad óptica (OD) a 550 nm y 680 nm cada dos días hasta OD alcanza 0.2-0.3 (que requiere por lo general 5-7 días). - Detener la incubación y las botellas de stock en un banco de 24-48 h permitir que las células de las algas para asentarse por gravedad.
Nota: Las células colocadas se utilizará luego para inocular los fotobiorreactores de columna de burbuja. Si se desea una colección más rápida de la célula, las células pueden ser centrifugadas a no más de 1.000 x g para recoger células.
3. cultivo de microalgas en fotobiorreactores de columna de burbuja
- El día antes de la inoculación del biorreactor, preparar los medios apropiados y transferencia 200 mL (o volumen) en el fotobiorreactor de columna de burbuja tubos (tubos de hibridación). Autoclave tubos con medios de comunicación y las tapas de ventilación en el lugar.
Nota: Si utiliza aguas residuales como un medio de cultivo, autoclave del vacío biorreactores y estéril filtrado de aguas residuales (si se desea cultivo axénico). - Concentrar la población de microalgas establecida eliminando el sobrenadante usando una bomba de vacío. Dejar menos de 100 mL de medio en cada botella pero evitar quitar algas colocadas.
Nota: Realizar este procedimiento dentro de un BSC y seguir una técnica aséptica. Un simple aparato de vacío se puede construir usando un termo o botella. Colocar una pipeta serológica estéril en el extremo de la tubería. - Suspender y transferir la mezcla de algas a tubos de centrífuga estériles de 50 mL. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a concentración de algas.
- En el BSC, quite suficiente sobrenadante para alcanzar un volumen total de ~ 80 mL de concentrados de algas para 12 photobioreacters. Evite aspirar el sedimento. Transfiera el concentrado de algas a un recipiente estéril (o la botella de stock utiliza algas).
- Añadir 6 mL de la mezcla de algas en cada fotobiorreactor con una pipeta serológica estéril de 10 mL.
- Estéril (filtro 0,2 mm jeringa o vacío) y añadir cantidades apropiadas de otros compuestos (por ejemplo, las reservas de vitamina) que no pueden esterilizarse en autoclave.
- Biorreactores para mezclar las algas en el medio del remolino.
- Extraer una muestra de 2 mL de cada biorreactor utilizando una pipeta serológica y transfiéralo a un tubo de 2 mL. Recoge una muestra de 2 mL (en un BSC) cada 24 h para supervisar el progreso de la cultura. Compruebe la muestra para pH utilizando tiras de prueba y ajuste el reactor según sea necesario con cada 3 M de NaOH o HCl M 3.
- Apriete las tapas del biorreactor y coloque todos los Biorreactores en el baño de agua del tanque de peces. Ajustar la iluminación al nivel apropiado para la especie, aireación y CO2. Gire a la posición de biorreactor cada día después de la toma de muestras (paso 3.8).
- Aplique 200 μL de cada muestra de cultura por triplicado a los pocillos de una microplaca 96 bien. Medir la densidad óptica (OD) a 550 nm y 680 nm.
- En el último día del período de la cultura, mida OD bajo factores de dilución diferentes (por ejemplo, un 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x y 32 x) para establecer una correlación entre el OD y el peso seco después de la cosecha (paso 4).
- Centrifugar el tubo de muestra de 2 mL a 12.000 x g durante 5 minutos.
- Filtrar el sobrenadante a través de 0,2 μm filtro de jeringas no estériles y guarde el sobrenadante (y pelotilla si es necesario) en no superior a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo y posteriores análisis de los cambios en la composición de los medios de comunicación.
4. la cosecha y la congelación de secado de biomasa Microalgal
- Medir un volumen fijo de la cultura de algas de cada biorreactor con una probeta graduada (por ejemplo, 160 mL de un biorreactor originalmente contenía 200 mL de medio) y transferir en botellas de centrífuga. Enjuague el cilindro graduado con dH2O entre cada medición.
- Centrífuga a 4.696 x g por 5 min desechar el sobrenadante por aspiración cuidadosamente hacia fuera.
- Transferir las pelotillas a tubos etiquetados 50 mL. Enjuague las botellas de centrífuga con dH2O y transferencia de contenido en los tubos de 50 mL. Asegúrese de que el volumen total del tubo no supere 45 mL.
- Lavar los gránulos de algas con dH2O para eliminar las sales.
- Centrifugar los tubos de 50 mL a 4.696 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
- Añadir 40 mL dH2O a cada tubo de 50 mL; Vortex para mezclar. Centrifugar nuevamente a 4.696 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
- Repetir paso 4.4.2.
- Etiqueta y pesar los tubos de centrífuga de 15 mL vacía en una balanza de 4 decimales (etiqueta de la tapa y el tubo y pesarlos juntos). Pesa un tubo por la cultura de las algas. Pese cada tubo 15 mL dos veces para minimizar el error.
- Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y añadir a cada tubo 50 mL 7,5 mL de dH2O. Las mezclas de algas en los 15 mL previamente pesado tubos de vórtice y transferencia. Enjuague los tubos de 50 mL con adicional dH2O y transferencia de líquidos en los tubos de 15 mL. No superior a 12 mL de volumen total en los tubos de 15 mL.
- Centrifugar los tubos de 15 mL a 4.696 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante. Se congelan los tubos con gránulos a-80 ° C durante al menos 30 minutos en la preparación de la liofilización.
- Congelación en seco durante la noche o hasta que se seca.
- Pesar y registrar los tubos de 15 mL liofilizado con algas.
5. extracción usando un método de Folch modificado24
- Pesar 20 mg de liofilizado biomasa algal en un tubo de polipropileno roscado de 2 mL (check fabricante etiqueta para producto es conveniente para las extracciones de bolas).
- Añadir 1,5 mL de disolvente de Folch (2:1 Cloroformo/metanol) a cada tubo 2 mL (que contiene 20 mg de liofilizado algas). Vierta ~0.5 granos de zirconio/sílice de mL (0,5 mm) en cada tubo hasta que llegue a nivel de líquido en tubo de 2 mL.
PRECAUCIÓN: Manejar cloroformo y metanol en una campana de humos y Evite respirar vapores o contacto con la piel. - Homogeneizar las muestras de algas en un molino de grano de 20 s a una velocidad de 6,5 tubos de transferencia m/s. de hielo de 30 s para enfriar las muestras. Repita cinco veces más plenamente, extraer los lípidos.
- Filtrar el homogeneizado con una jeringa de 5 mL que contiene un disco de malla de alambre de acero inoxidable (60 mesh) filtrar hacia fuera las cuentas, recoger el filtrado en un tubo de 15 mL.
- Lavar los granos con 1,5 mL de disolvente de Folch, empujando el líquido a través de con la jeringa si es necesario. Repita este lavado dos veces más y recoger todo filtrado en el tubo de 15 mL, produciendo un volumen final de aproximadamente 6 mL.
- Añadir 1,2 mL de 0.9% (w/v) el extracto de Folch en el tubo de 15 mL una solución de NaCl y agitar para mezclar bien.
Nota: Si es necesario, más solvente de Folch se puede utilizar para lavar granos (uso 0.2 x el volumen total de lavado de la solución de NaCl al 0,9% para inducir la separación de fases). - Centrifugar los tubos de 15 mL a 6.000 x g durante 5 minutos registro el volumen de fase (verde) de cloroformo inferior a lo 0,1 mL más cercano mediante líneas en el lado del tubo de 15 mL. La transferencia de la fase de fondo a un frasco de vidrio (con tapa) con un pipeta Pasteur de vidrio.
- Almacenar el lípido a-20 ° C o -80 ° C (si hay planes de usar este extracto para el análisis de ácidos grasos).
6. Neutral lípidos ensayo utilizando un método de microplaca (adaptado de Higgins et al. 201422)
- Preparar soluciones madre. Preparación estándar de aceite vegetal de 1 mg/mL 10 mL de cloroformo y almacenar a-20 ° C.
Nota: Cualquier aceite vegetal puede ser utilizado en este ensayo porque no es sensible a los tipos de ácidos grasos. Preparar 10 mL de solución de rojo de Nilo en dimetil sulfóxido (DMSO) de 200 μg/mL y almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente. - Bloque de microplacas seco precaliente a 55 ° C en una campana de humos. Mientras esto se está calentando, diluir los extractos de lípidos y aceite estándar 3-fold con metanol.
Nota: Esta dilución puede modificarse basándose en el contenido de lípidos de las algas, pero este nivel funciona bien para la mayoría de Chlorella. - Para cada muestra diluida, agregar 80 μl a una microplaca 96 bien polipropileno por cuadruplicado.
PRECAUCIÓN: Uso de recipientes de plástico poliestireno no se recomienda para su uso con solventes orgánicos. - Para que el disolvente en blanco, aplicar 80 μl de 2:1 metanol/cloroformo por cuadruplicado. Normas, añadir 10, 30, 60, 90 y 120 μl del diluido aceite vegetal estándar por cuadruplicado.
- Colocar la microplaca en un calentador de bloque seco a 55 º C durante 20-30 min hasta que se evapore el disolvente de todos. Mientras que el solvente se evapora, preparar el trabajo solución de rojo de Nilo (necesidad de 200 μL de solución de 1 μg/ml por placa bien). Por ejemplo, doce muestras y un conjunto completo de normas requiere 16 mL de solución de 1,0 μg/mL; preparar disolviendo 80 μl del stock de 200 μg/mL (en DMSO) en 16 mL dH2O.
- Retire la microplaca del bloque calefactor y deje enfriar a temperatura ambiente. Añadir 30 μl de alcohol isopropílico a cada pozo y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Asegúrese de que todos los canales pipeta se mezcla la solución y resuspender los lípidos, produciendo un líquido verde homogéneo.
- Añadir 200 μL de solución de rojo del Nilo (1 μg/mL) a cada pozo, pipeta arriba/abajo 10 veces para mezclar. Incubar la placa por 5 min a temperatura ambiente. Mientras espera, prepare una solución de lejía de 50% mediante la mezcla de lejía (hipoclorito al 6%) con dH2o 20 μl por pozo son necesarios. Preparación de 3 mL de lejía de 50% es suficiente para 12 muestras y un conjunto completo de normas.
- Añadir 20 μl de solución de lejía a cada microplaca bien y pipetear arriba y abajo 5 veces para mezclar bien. Incubar 30 min a temperatura ambiente.
- Después de 30 minutos, leer la fluorescencia en las muestras cada 5-10 min en 530 emisión de nm de excitación/575 nm con corte automático a 570 nm hasta que se estabilice la señal de las muestras de algas. Por lo general, 60 min de incubación total es suficiente.
- Crear una curva de calibración para los estándares de aceite vegetal (en el rango de 0-40 ng/pozo de petróleo).
Nota: Montar un lineal funciona bien para bajo (< 30 ng/pozo) las concentraciones de aceite y un polinomio de ajuste pueden utilizarse si el estándar es superior a 30 ng/bien. Utilice esta correlación para cuantificar el lípido neutral en los pocillos de la muestra.
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Resultados
Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de algas densidad óptica OD 550 nm (Figura 4A). La densidad óptica y peso seco de concentración pueden ser datos correlacionados (Figura 4B). Esto se logra mediante el primer cálculo de la concentración de algas de peso seco final después del paso de liofilización. A continuación, puede correlacionarse la densidad óptica de la dilución serial de cultura (realizado en el últim...
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Discusión
La consideración más importante al cultivo de algas es un entendimiento de las necesidades específicas del organismo o grupo de organismos. Las algas en el sistema de cultivo aquí descrito puede utilizarse para una amplia gama de las algas pero los específicos factores abióticos (temperatura, media, pH, intensidad de luz, nivel de CO2 , tasa de aireación) de la cultura deben ajustarse a las necesidades del organismo. Tenga en cuenta los parámetros aquí descritos fueron utilizados para el cultivo de Chlorel...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Apoyo para esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura Portilla proyecto ALA0HIGGINS y las oficinas de la Universidad de Auburn de preboste, el Vicepresidente para la investigación y la escuela de ingeniería de Samuel Ginn. También fue apoyado por la NSF concede CBET-1438211.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Suministros para la instalación de fotobiorreactores de transporte aéreo | |||
| 1 L Botellas de Pyrex | Corning | 16157-191 | Para reactores de botella, humidificadores |
| Abrazadera de manguera de 1/2" | Home Depot | UC953A | o equivalente |
| 1/4" luer hembra a lengüeta | Nordson biomédico Nordson | FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| Tubo de PVC autoclavable de 1/4" de diámetro interior, 3/8" de diámetro | exterior Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50'1 |
| /4" en juntas tóricas | Grainger | 1REC5 | #010 Junta tórica de silicona de dureza media, 0,239" de diámetro interior, 0,379" de diámetro exterior |
| 1/8" Luer a lengüeta hembra | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD Tubo de PVC esterilizable en autoclave | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250'1 |
| /8" macho giratorio luer a lengüeta | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| /8" lengüeta multipuerto | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" lengüeta |
| 1/8" NPT a lengüeta | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series lengüeta |
| /8" montaje en panel luer | Nordson biomedical Nordson | MLRLB230-6005 1 | /8", PP |
| 10 galones pecera | 802262 Puede contener hasta 8 biorreactores dependiendo del diseño | ||
| Medidor de flujo de 100-1000 ccm | Dwyer | RMA-13-SSV | Para reactores de botella |
| de 2 pies banco de luz fluorescente | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm caudalímetro | Dwyer | RMA-14-SSV | Para la regulación del aire aguas arriba del humidificador |
| 250 mL Botellas Pyrex | Corning | 16157-136 | Para la mezcla de gases después del humidificador |
| Caudalímetro de 50-500 ccm | Dwyer | RMA-12-SSV | Para reactores tubulares de hibridación |
| Caudalímetro de 5-50 ccm | Dwyer | RMA-151-SSV | Para el control del caudal de CO2 Filtros |
| aire 0.2 y micro; m | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0,2 y micro; m, PTFE, paquete de 50 |
| válvulas de retención | VWR | 89094-714 | |
| Tapas Corning para botellas de pyrex | VWR | 89000-233 | 10 tapas GL45 |
| Tapón luer hembra | Nordson biomedical Nordson | FTLLP-6005 | Tubo |
| hibridación | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, paquete de 2 |
| Temporizador de luz | Walmart | 556393626 | |
| Tuercas de seguridad | Nordson biomedical Nordson | LNS-3 | 1/4", nylon rojo |
| Agitador magnético de perfil bajo | VWR | 10153-690 | Agitador magnético de perfil bajo |
| Tapa de luer macho | Nordson biomedical Nordson | LP4-6005 | Tapón macho PP |
| Anillo de bloqueo Luer giratorio | Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005 | ||
| Barras de agitación - | largas VWR | 58949-040 | 38,1 mm, para reactores de botella |
| Barras de agitación - medianas | VWR | 58949-034 | 25 mm, para tubos de hidridación |
| Suministros y reactivos para el cultivo de algas | |||
| 0,2 y micro; m filtros | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, para filtrar medios gastados de muestreo diario de cultivo |
| jeringas de 1 mL | Air-tite | 89215-216 | Para filtrar medios gastados de muestreo diario de cultivo |
| 1,5 mL | VWR | 87003-294 | Estériles (o equivalentes) |
| 10 mL Pipetas serológicas | Greiner Bio-One | 82050-482 | Estériles (o equivalentes) |
| 100 mm placas | VWR | 25384-342 placas de | Petri apilables de 100x15 mm, estériles |
| tubos de 15 mL | Greiner Bio-One | 82050-276 | Estéril (o equivalente), polipropileno |
| 2 mL Puntas de pipeta serológicas | Greiner Bio-One | 82051-584 | Estériles (o equivalentes) |
| Tubos de 2 mL | VWR | 87003-298 | Tubos estériles (o equivalentes) |
| de 50 mL | Greiner Bio-One | 82050-348 | Polipropileno estéril (o equivalente) |
| Microplaca de 96 pocillos | Greiner Bio-One | 89089-578 | Poliestireno con tapa, fondo plano |
| Asas de inocculación | VWR | 80094-478 | Estéril (o equivalente) |
| Tanque y regulador de dióxido de carbono líquido | Airgas | CD-50 | |
| Suministros y reactivos para la extracción de lípidos y el ensayo de lípidos neutros | |||
| 2 ml | VWR | 10158-556 Tubo de | polipropileno con tapa |
| Microplacas de 96 pocillos | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polipropileno, fondo plano |
| Lejía Walmart | 550646751 | Solo use lejía regular, no lejía de limpieza | |
| Cloroformo | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimetilsulfóxido | BDH | BDH1115-1LP | |
| Alcohol isopropílico | BDH | BDH1133-1LP | |
| Metanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Rojo Nilo | VWR | TCN0659-5G | |
| Puntas de pipeta Pasteur | VWR | 14673-010 | |
| Cloruro de sodio | BDH | BDH9286-500G | |
| Aceite vegetal | Walmart | 9276383 | Cualquier aceite vegetal debe funcionar siempre que sea fresco |
| Perlas de circonio/sílice (0,5 mm de diámetro) | Productos Biospec | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capaz de una precisión de al menos 4 decimales |
| Homogeneizador de perlas | Omni | 19-040E | |
| Microcentrífuga de sobremesa | Thermo | Heraeus Fresco 21 con rotor 24x2 | Incluye capaz de manejar tubos de 1,5 y 2 mL |
| Calentador de bloque seco | VWR | 75838-282 | Incluye bloque seco para una microplaca |
| Liofilizador | Labconco | 7670520 | Sistema de liofilización de 2,5 L |
| Centrífuga de sobremesa grande | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Incluye rotores capaces de manejar botellas de 400 mL, tubos de 50 mL y tubos de 15 mL Lector de |
| microplacas | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capaz de leer absorbancia y fluorescencia |
| Mezclador de vórtice | VWR | 10153-838 |
Referencias
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